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Klinische Leitlinien kamagra viagra gelee bewertungen sind zu einem Kernelement bei der Optimierung der Versorgung von Patienten mit Herz-Kreislauf-Erkrankungen geworden. Die Qualität der Richtlinien hängt jedoch von einem strengen unvoreingenommenen Prozess ab, der die klinischen Beweise mit dem Input einer Reihe von Interessengruppen integriert. In dieser Ausgabe von Heart fasst Garbi1 die Prinzipien und Prozesse des National Institute for Health and Care Excellence (NICE) für die Entwicklung klinischer Richtlinien in England zusammen., Die Diskussion kamagra viagra gelee bewertungen gliedert sich in vier Schlüsselbereiche.
(1) Die Entwicklung von Leitlinien durch einen unabhängigen beratenden Ausschuss umfasst die Ausrichtung von Empfehlungen auf die nationale Gesundheitspolitik und die Einbeziehung von Patienten, Patientenanwälten und der Ãffentlichkeit sowie Angehörigen der Gesundheitsberufe. (2) Die Empfehlungen sollten sich auf relevante, zuverlässige und belastbare Beweise stützen und die Kosteneffizienz und den Nutzen für die Bevölkerung berücksichtigen. (3) Leitlinien sollten Innovationen kamagra viagra gelee bewertungen unterstützen und Ungleichheiten im Gesundheitswesen verringern.
(4) SchlieÃlich sind die Gewährleistung der Umsetzung der Leitlinie und die regelmäÃige Aktualisierung unerlässlich.,Im begleitenden Editorial vergleichen Otto, Kudenchuk und Newby2 die NICE-Methodik mit dem aktuellen Ansatz unserer kardiovaskulären Fachgesellschaften sowie mit etablierten Berichtskriterien für klinische Praxisleitlinien (Abbildung 1).,3 Sie schlagen mehrere Bereiche zur Verbesserung vor, darunter die kooperative Entwicklung einer gemeinsamen Evidenzdatenbank, einen strengen transparenten Prozess auf der Grundlage etablierter Standards, eine vielfältigere Gruppe von Interessengruppen, die Minimierung von Interessenkonflikten, die Unterstützung durch Informationsspezialisten, medizinische Autoren und andere relevante Experten, regelmäÃige Aktualisierungen, Anpassung an regionale Erwägungen sowie verbesserte Verbreitungs-und Zugangsmethoden. Wie sie folgern. à ⬠Aktuelle Leitlinien der kardiovaskulären Gesellschaft kamagra viagra gelee bewertungen verfehlen Best Practice.
Wir können und müssen es besser machen.,âÂÂVisuelle Zusammenfassung der Berichtskriterien für Leitlinien für die klinische Praxis, wie in der Bewertung von Leitlinien, Forschung und Bewertung (AGREE) Checkliste detailliert."data-icon-position data-hide-link-title=" 0 " >Abbildung 1 Visuelle Zusammenfassung der Berichtskriterien für Richtlinien der klinischen Praxis, wie in der Checkliste zur Bewertung von Richtlinien, Forschung und Bewertung (AGREE) beschrieben.,Bei Patienten mit Vorhofflimmern (AF) mit mäÃigem oder hohem Schlaganfallrisiko haben randomisierte kontrollierte Studien (RCTs) eine Ãberlegenheit oder Nichtunterlegenheit von Nicht-Vitamin-K-oralen Antikoagulanzien (NOACs) gegenüber Vitamin-K-Antikoagulanzien (VKA) zur Vorbeugung von Schlaganfall oder systemischer Embolie sowie verringerte Raten von intrakraniellen Blutungen gezeigt. Patienten mit RCTs sind jedoch möglicherweise nicht repräsentativ für die gesamte Palette von Patienten, die in der klinischen Praxis beobachtet werden., Um dieses Problem anzugehen, verwendeten Camm und colleagues4 eine Methode namens Overlap propensity Matching, um die Wirksamkeit von VKA und verschiedenen NOACs für Mortalität, Schlaganfall/systemische Embolie und schwere Blutungen bei Patienten mit neu diagnostizierter AF und eine Indikation für orale Antikoagulation zu vergleichen. Basierend auf 25 551 Patienten in der Global Anticoagulant Registry in the FIELD-Vorhofflimmern kamagra viagra gelee bewertungen (GARFIELD-AF) Studie, bestätigten sie, dass â ⬠Wichtige Vorteile in Bezug auf Mortalität und schwere Blutungen mit NOAC im Vergleich zu VKA ohne Unterschied zwischen NOAC subtypesâ beobachtet wurden (Abbildung 2).,Adjusted* HRs und entsprechende 95% CIs für ausgewählte Ergebnisse nach 2 Jahren Follow-up durch OAC-Behandlung zu Studienbeginn.
Die BezugsgröÃe ist die als zweite gemeldete Behandlung. * Unter Verwendung eines überlappungsgewichteten Cox-Modells erhalten.,s in der Gewichtung Schema enthalten sind. Land und Kohorte Einschreibung, Geschlecht, Alter, ethnische Zugehörigkeit, Art der AF, Pflege, Spezialität und Lage, Herzinsuffizienz, akute koronare Syndrome, GefäÃerkrankungen, Karotis Verschlusskrankheit, vor Schlaganfall/TIA/SE, vor Blutungen, venöse Thromboembolie, Bluthochdruck, Hypercholesterinämie, Diabetes, Zirrhose, mittelschwere bis schwere chronische Nierenerkrankung, Demenz, Hyperthyreose, Hypothyreose, aktuelles Rauchen, starker Alkoholkonsum, Body-Mass-Index (BMI) kamagra viagra gelee bewertungen herzfrequenz, systolischer und diastolischer Blutdruck bei Diagnose und Ausgangsanwendung von Thrombozytenaggregationshemmern., DTI, direkter Thrombininhibitor.
FXaI, Faktor Xa-Hemmer. NOAC, orale Antikoagulanzien ohne Vitamin K. OAC, orale Antikoagulanzien kamagra viagra gelee bewertungen.
SE, systemische Embolie. TIA, vorübergehender ischämischer kamagra viagra gelee bewertungen Anfall. VKA, Vitamin K-Antagonisten."data-icon-position-Daten-hide-link-title="0">Abbildung 2 Angepasst* Uhr und die entsprechenden 95% CIs für den ausgewählten outcomes at 2 years follow-up von OAC Behandlung zu Studienbeginn.
Die BezugsgröÃe ist die als zweite gemeldete Behandlung. * Unter Verwendung eines überlappungsgewichteten Cox-Modells erhalten.,s in der Gewichtung kamagra viagra gelee bewertungen Schema enthalten sind. Land und Kohorte Einschreibung, Geschlecht, Alter, ethnische Zugehörigkeit, Art der AF, Pflege, Spezialität und Lage, Herzinsuffizienz, akute koronare Syndrome, GefäÃerkrankungen, Karotis Verschlusskrankheit, vor Schlaganfall/TIA/SE, vor Blutungen, venöse Thromboembolie, Bluthochdruck, Hypercholesterinämie, Diabetes, Zirrhose, mittelschwere bis schwere chronische Nierenerkrankung, Demenz, Hyperthyreose, Hypothyreose, aktuelles Rauchen, starker Alkoholkonsum, Body-Mass-Index (BMI) herzfrequenz, systolischer und diastolischer Blutdruck bei Diagnose und Ausgangsanwendung von Thrombozytenaggregationshemmern., DTI, direkter Thrombin-Inhibitor.
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SE, systemische Embolie. TIA, vorübergehender ischämischer kamagra viagra gelee bewertungen Anfall. VKA, Vitamin K antagonists.In das begleitende Editorial, Choi und Lee5 weisen auf die Stärken dieser Studie hin, einschlieÃlich einer klinisch vielfältigen internationalen Patientenkohorte mit regelmäÃigen Audits und einer geringen Follow-up-Rate, einer ausgeklügelten Matching-Methode und Ergebnissen, die mit früheren RCTs übereinstimmen., Zu den Einschränkungen gehören jedoch die Möglichkeit von Restkonfunden.
Mögliches Absetzen oder Wechseln von Medikamenten während dieses Studienzeitraums. Fehlen detaillierter Daten zu Arten von schweren Blutungen und regionalen oder ethnischen Unterschieden in den Ergebnissen kamagra viagra gelee bewertungen. Und irgendwelche Auswirkungen aufgrund mangelnder Therapietreue.
Wie sie folgern âÂDas GARFIELD-AF-Register hat wertvolle klinische Praxis Muster in AF weltweit berichtet, aber es wird auch eine Rolle als pragmatische Studie für reale Praxis-basierte RCTs spielen.,âÂÂDie Prävalenz und die Ergebnisse von Erwachsenen über 65 Jahren mit mehr als milder Mitral Regurgitation (MR) oder trikuspid regurgitation (TR) wurde in 4755 Probanden untersucht, die Echokardiographie in der Oxford Valvular Heart Disease Population Study (OxVALVE) unterzogen hatte.6 Insgesamt betrug die Prävalenz von mittelschwerer oder gröÃerer MR 3,5% und TR 2,6% , wobei nur etwa die Hälfte dieser Patienten zuvor eine Klappenerkrankung diagnostiziert hatte. Probanden mit Regurgitation, die durch Screening identifiziert wurden, waren weniger symptomatisch als Patienten mit bekannter Klappenerkrankung., Die Ãtiologie von kamagra viagra gelee bewertungen MR war am häufigsten primär, obwohl 22% aufgrund einer linksventrikulären systolischen Dysfunktion sekundäre MR hatten (Abbildung 3). Während der 64-monatigen medianen Nachbeobachtung wurde selten ein chirurgischer Eingriff durchgeführt (2, 4%).Mechanismus der Mitralregurgitation (MR).
Die Mechanismen der Klapp-Dysfunktion bei Patienten mit mäÃiger oder gröÃerer MR werden nach Carpentier-Klassifikation gezeigt. Typ 1, normale Blättchenbewegung kamagra viagra gelee bewertungen und-position. Typ 2, überschüssige Blättchenbewegung.
Typ 3a, eingeschränkte kamagra viagra gelee bewertungen Blättchenbewegung in Systole und Diastole. Typ 3b, eingeschränkte Blättchenbewegung in Systole.,"data-icon-position-Daten-hide-link-title="0">Abbildung 3 Mechanismus der mitral regurgitation (MR). Die Mechanismen der Klapp-Dysfunktion bei Patienten mit mäÃiger oder gröÃerer MR werden nach Carpentier-Klassifikation gezeigt.
Typ 1, normale kamagra viagra gelee bewertungen Blättchenbewegung und-position. Typ 2, überschüssige Blättchenbewegung. Typ 3a, eingeschränkte Blättchenbewegung in Systole und Diastole.
Typ 3b, eingeschränkte Blättchenbewegung in Systole.,In einem Leitartikel weisen Bouleti und Iung7 darauf hin, dass die Prävalenz von MR und TR bei kamagra viagra gelee bewertungen Personen über 75 Jahren noch weiter zunimmt und dass die Anzahl der Patienten mit sekundärer MR und einer niedrigen linksventrikulären Ejektionsfraktion angesichts der Assoziation mit beeinträchtigtem Langzeitüberleben besorgniserregend ist. Sie kommen zu dem Schluss. ÃÂDiese Ergebnisse unterstreichen die Notwendigkeit, Ausbildungsprogramme zur Sensibilisierung auf Herz-Ventil-Krankheit, für die Bewertung der Einhaltung von Richtlinien und für die kontinuierliche Entwicklung und evaluation von weniger invasive Eingriffe targeting älteren Patienten.,âÂÂDer Education in Heart Artikel in dieser Ausgabe fasst den empfohlenen Ansatz für das Screening auf Herz-Kreislauf-Erkrankungen bei gesunden Menschen.8 A state-of-the-art-review-Artikel über die nukleare cardiology9 bietet einen überblick über die myokardiale perfusion-imaging-Methoden und klinische Anwendungen für koronare Herzkrankheit, Herzinsuffizienz und Herzinfarkt-Krankheiten und Infektionen., Neuere nukleare Bildgebungsansätze umfassen 18F-Fluorodeoxyglucose-Positronenemissions-Tomographie-Scans zur Diagnose einer infektiösen Endokarditis, insbesondere bei Patienten mit Klappenprothesen, und die Verwendung nuklearer Ansätze als Zusatz zur Diagnose von Sarkoidose und Amyloidose.Unsere Serie Cardiology in Focus setzt sich mit einem Artikel10 über Schwangerschaft während des Kardiologietrainings fort, der für Frauen, die eine Schwangerschaft während des Kardiologietrainings in Betracht ziehen (oder als beratender Kardiologe), für diejenigen hilfreich ist, die diese Frauen ausbilden und unterstützen (Abbildung 4).,Bedenken des schwangeren Kardiologen."data-icon-position data-hide-link-title=" 0 " >Abbildung 4 Betrifft die schwangere Kardiologin.Klinische Richtlinien spielen eine immer wichtigere Rolle bei der Versorgung von Patienten mit Herz-Kreislauf-Erkrankungen.
Ansätze zur Richtlinienentwicklung spiegeln die Notwendigkeit wider, eine komplexe und ständig wachsende Evidenzbasis mit neuen Behandlungsoptionen und klinischem Fachwissen zu integrieren, um Empfehlungen zu formulieren, die dann sowohl von einzelnen Gesundheitsdienstleistern als auch von allen Gesundheitssystemen implementiert werden können., Alle Leitlinien für einen bestimmten Krankheitszustand beginnen mit derselben Evidenzbasis, werden jedoch von vielen verschiedenen Organisationen auf vielfältige Weise entwickelt, wobei häufig dieselben oder sich überschneidende Arten von Herz-Kreislauf-Erkrankungen behandelt werden, was in der Regel zu zumindest subtilen (und manchmal schwerwiegenden) Abweichungen in den resultierenden Empfehlungen führt.,Empfehlungen der Fachgesellschaft, wie sie von der European Society of Cardiology (ESC) und der American Heart Association/American College of Cardiology (AHA/ACC) formuliert werden, überwiegen, aber viele geografische Regionen haben kamagra viagra gelee bewertungen eigene Richtlinien, die Empfehlungen auf spezifische regionale Anforderungen zugeschnitten sind.1 Staatliche Stellen und Versicherer erstellen auch Richtlinien entweder direkt in veröffentlichten Dokumenten oder indirekt durch Einschränkung der Erstattung., Online - medizinische Lehrbücher wie Up-to-Date versuchen, Empfehlungen aus mehreren Leitlinienquellen zu integrieren und abzugleichen und Lücken im klinischen Management mit Empfehlungen zu füllen, die allein auf klinischem Fachwissen basieren. Ein anderer Ansatz besteht darin, eine unabhängige Expertengruppe einzuberufen, die sich mit neuen Praktiken befasst, die die Evidenz schnell ändern, und sich auf eine bestimmte Frage konzentriert, z. B.
Die BMJ kamagra viagra gelee bewertungen Rapid Recs oder Magic Evidence Ecosystem Foundation.2 3warum gibt es so viele Richtlinien?. Was sind die Grenzen unseres derzeitigen Ansatzes?. , Wie können wir die Leitlinienentwicklung optimieren, um die Versorgung von Patienten mit Herz-Kreislauf-Erkrankungen zu verbessern?.
Alle Leitlinien kamagra viagra gelee bewertungen verfolgen zwei gemeinsame Ziele. Erstens die Ãberprüfung, Bewertung der Qualität, Zusammenfassung und Interpretation der veröffentlichten Evidenzbasis und zweitens klare Empfehlungen für das Patientenmanagement. Andere Ziele können zwischen Richtlinien abweichen, wie das Gleichgewicht zwischen dem Wohl des einzelnen Patienten und der Gesundheit der Bevölkerung, Ãberlegungen zur Kosteneffizienz, â¦.
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(1) Die Entwicklung von Leitlinien durch einen unabhängigen beratenden Ausschuss umfasst die Ausrichtung von Empfehlungen auf die nationale Gesundheitspolitik und die Einbeziehung von Patienten, Patientenanwälten und der Ãffentlichkeit sowie Angehörigen der Gesundheitsberufe. (2) Die Empfehlungen sollten sich auf relevante, zuverlässige und belastbare Beweise stützen und die Kosteneffizienz und den Nutzen für die Bevölkerung berücksichtigen. (3) Leitlinien sollten Innovationen unterstützen und Ungleichheiten im niedrigster preis kamagra Gesundheitswesen verringern.
(4) SchlieÃlich sind die Gewährleistung der Umsetzung der Leitlinie und die regelmäÃige Aktualisierung unerlässlich.,Im begleitenden Editorial vergleichen Otto, Kudenchuk und Newby2 die NICE-Methodik mit dem aktuellen Ansatz unserer kardiovaskulären Fachgesellschaften sowie mit etablierten Berichtskriterien für klinische Praxisleitlinien (Abbildung 1).,3 Sie schlagen mehrere Bereiche zur Verbesserung vor, darunter die kooperative Entwicklung einer gemeinsamen Evidenzdatenbank, einen strengen transparenten Prozess auf der Grundlage etablierter Standards, eine vielfältigere Gruppe von Interessengruppen, die Minimierung von Interessenkonflikten, die Unterstützung durch Informationsspezialisten, medizinische Autoren und andere relevante Experten, regelmäÃige Aktualisierungen, Anpassung an regionale Erwägungen sowie verbesserte Verbreitungs-und Zugangsmethoden. Wie sie folgern. à ⬠Aktuelle Leitlinien der kardiovaskulären Gesellschaft verfehlen Best niedrigster preis kamagra Practice.
Wir können und müssen es besser machen.,âÂÂVisuelle Zusammenfassung der Berichtskriterien für Leitlinien für die klinische Praxis, wie in der Bewertung von Leitlinien, Forschung und Bewertung (AGREE) Checkliste detailliert."data-icon-position data-hide-link-title=" 0 " >Abbildung 1 Visuelle Zusammenfassung der Berichtskriterien für Richtlinien der klinischen Praxis, wie in der Checkliste zur Bewertung von Richtlinien, Forschung und Bewertung (AGREE) beschrieben.,Bei Patienten mit Vorhofflimmern (AF) mit mäÃigem oder hohem Schlaganfallrisiko haben randomisierte kontrollierte Studien (RCTs) eine Ãberlegenheit oder Nichtunterlegenheit von Nicht-Vitamin-K-oralen Antikoagulanzien (NOACs) gegenüber Vitamin-K-Antikoagulanzien (VKA) zur Vorbeugung von Schlaganfall oder systemischer Embolie sowie verringerte Raten von intrakraniellen Blutungen gezeigt. Patienten mit RCTs sind jedoch möglicherweise nicht repräsentativ für die gesamte Palette von Patienten, die in der klinischen Praxis beobachtet werden., Um dieses Problem anzugehen, verwendeten Camm und colleagues4 eine Methode namens Overlap propensity Matching, um die Wirksamkeit von VKA und verschiedenen NOACs für Mortalität, Schlaganfall/systemische Embolie und schwere Blutungen bei Patienten mit neu diagnostizierter AF und eine Indikation für orale Antikoagulation zu vergleichen. Basierend auf 25 551 Patienten in der Global Anticoagulant Registry in the FIELD-Vorhofflimmern (GARFIELD-AF) Studie, bestätigten niedrigster preis kamagra sie, dass â ⬠Wichtige Vorteile in Bezug auf Mortalität und schwere Blutungen mit NOAC im Vergleich zu VKA ohne Unterschied zwischen NOAC subtypesâ beobachtet wurden (Abbildung 2).,Adjusted* HRs und entsprechende 95% CIs für ausgewählte Ergebnisse nach 2 Jahren Follow-up durch OAC-Behandlung zu Studienbeginn.
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Wie sie folgern âÂDas GARFIELD-AF-Register hat wertvolle klinische Praxis Muster in AF weltweit berichtet, aber es wird auch eine Rolle als pragmatische Studie für reale Praxis-basierte RCTs spielen.,âÂÂDie Prävalenz und die Ergebnisse von Erwachsenen über 65 Jahren mit mehr als milder Mitral Regurgitation (MR) oder trikuspid regurgitation (TR) wurde in 4755 Probanden untersucht, die Echokardiographie in der Oxford Valvular Heart Disease Population Study (OxVALVE) unterzogen hatte.6 Insgesamt betrug die Prävalenz von mittelschwerer oder gröÃerer MR 3,5% und TR 2,6% , wobei nur etwa die Hälfte dieser Patienten zuvor eine Klappenerkrankung diagnostiziert hatte. Probanden mit Regurgitation, die durch Screening identifiziert wurden, waren weniger symptomatisch als Patienten mit bekannter Klappenerkrankung., Die Ãtiologie von MR war am häufigsten primär, obwohl 22% aufgrund einer linksventrikulären systolischen Dysfunktion sekundäre niedrigster preis kamagra MR hatten (Abbildung 3). Während der 64-monatigen medianen Nachbeobachtung wurde selten ein chirurgischer Eingriff durchgeführt (2, 4%).Mechanismus der Mitralregurgitation (MR).
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Typ 3a, eingeschränkte Blättchenbewegung in Systole und Diastole niedrigster preis kamagra. Typ 3b, eingeschränkte Blättchenbewegung in Systole.,"data-icon-position-Daten-hide-link-title="0">Abbildung 3 Mechanismus der mitral regurgitation (MR). Die Mechanismen der Klapp-Dysfunktion bei Patienten mit mäÃiger oder gröÃerer MR werden nach Carpentier-Klassifikation gezeigt.
Typ 1, normale Blättchenbewegung niedrigster preis kamagra und-position. Typ 2, überschüssige Blättchenbewegung. Typ 3a, eingeschränkte Blättchenbewegung in Systole und Diastole.
Typ 3b, eingeschränkte Blättchenbewegung in Systole.,In einem Leitartikel weisen Bouleti und Iung7 darauf hin, dass die niedrigster preis kamagra Prävalenz von MR und TR bei Personen über 75 Jahren noch weiter zunimmt und dass die Anzahl der Patienten mit sekundärer MR und einer niedrigen linksventrikulären Ejektionsfraktion angesichts der Assoziation mit beeinträchtigtem Langzeitüberleben besorgniserregend ist. Sie kommen zu dem Schluss. ÃÂDiese Ergebnisse unterstreichen die Notwendigkeit, Ausbildungsprogramme zur Sensibilisierung auf Herz-Ventil-Krankheit, für die Bewertung der Einhaltung von Richtlinien und für die kontinuierliche Entwicklung und evaluation von weniger invasive Eingriffe targeting älteren Patienten.,âÂÂDer Education in Heart Artikel in dieser Ausgabe fasst den empfohlenen Ansatz für das Screening auf Herz-Kreislauf-Erkrankungen bei gesunden Menschen.8 A state-of-the-art-review-Artikel über die nukleare cardiology9 bietet einen überblick über die myokardiale perfusion-imaging-Methoden und klinische Anwendungen für koronare Herzkrankheit, Herzinsuffizienz und Herzinfarkt-Krankheiten und Infektionen., Neuere nukleare Bildgebungsansätze umfassen 18F-Fluorodeoxyglucose-Positronenemissions-Tomographie-Scans zur Diagnose einer infektiösen Endokarditis, insbesondere bei Patienten mit Klappenprothesen, und die Verwendung nuklearer Ansätze als Zusatz zur Diagnose von Sarkoidose und Amyloidose.Unsere Serie Cardiology in Focus setzt sich mit einem Artikel10 über Schwangerschaft während des Kardiologietrainings fort, der für Frauen, die eine Schwangerschaft während des Kardiologietrainings in Betracht ziehen (oder als beratender Kardiologe), für diejenigen hilfreich ist, die diese Frauen ausbilden und unterstützen (Abbildung 4).,Bedenken des schwangeren Kardiologen."data-icon-position data-hide-link-title=" 0 " >Abbildung 4 Betrifft die schwangere Kardiologin.Klinische Richtlinien spielen eine immer wichtigere Rolle bei der Versorgung von Patienten mit Herz-Kreislauf-Erkrankungen.
Ansätze zur Richtlinienentwicklung spiegeln die Notwendigkeit wider, eine komplexe und ständig wachsende Evidenzbasis mit neuen Behandlungsoptionen und klinischem Fachwissen zu integrieren, um Empfehlungen zu formulieren, die dann sowohl von einzelnen Gesundheitsdienstleistern als auch von allen Gesundheitssystemen implementiert werden können., Alle Leitlinien für einen bestimmten Krankheitszustand beginnen mit derselben Evidenzbasis, werden jedoch von vielen verschiedenen Organisationen auf vielfältige Weise entwickelt, wobei häufig dieselben oder sich überschneidende Arten von Herz-Kreislauf-Erkrankungen behandelt werden, was in der Regel zu zumindest subtilen (und manchmal schwerwiegenden) niedrigster preis kamagra Abweichungen in den resultierenden Empfehlungen führt.,Empfehlungen der Fachgesellschaft, wie sie von der European Society of Cardiology (ESC) und der American Heart Association/American College of Cardiology (AHA/ACC) formuliert werden, überwiegen, aber viele geografische Regionen haben eigene Richtlinien, die Empfehlungen auf spezifische regionale Anforderungen zugeschnitten sind.1 Staatliche Stellen und Versicherer erstellen auch Richtlinien entweder direkt in veröffentlichten Dokumenten oder indirekt durch Einschränkung der Erstattung., Online - medizinische Lehrbücher wie Up-to-Date versuchen, Empfehlungen aus mehreren Leitlinienquellen zu integrieren und abzugleichen und Lücken im klinischen Management mit Empfehlungen zu füllen, die allein auf klinischem Fachwissen basieren. Ein anderer Ansatz besteht darin, eine unabhängige Expertengruppe einzuberufen, die sich mit neuen Praktiken befasst, die die Evidenz schnell ändern, und sich auf eine bestimmte Frage konzentriert, z. B.
Die BMJ Rapid Recs oder Magic Evidence Ecosystem niedrigster preis kamagra Foundation.2 3warum gibt es so viele Richtlinien?. Was sind die Grenzen unseres derzeitigen Ansatzes?. , Wie können wir die Leitlinienentwicklung optimieren, um die Versorgung von Patienten mit Herz-Kreislauf-Erkrankungen zu verbessern?.
Alle Leitlinien niedrigster preis kamagra verfolgen zwei gemeinsame Ziele. Erstens die Ãberprüfung, Bewertung der Qualität, Zusammenfassung und Interpretation der veröffentlichten Evidenzbasis und zweitens klare Empfehlungen für das Patientenmanagement. Andere Ziele können zwischen Richtlinien abweichen, wie das Gleichgewicht zwischen dem Wohl des einzelnen Patienten und der Gesundheit der Bevölkerung, Ãberlegungen zur Kosteneffizienz, â¦.
Anmerkung des ajanta pharma kamagra preis Herausgebers (5/13/21) blog link. Nachdem diese Geschichte veröffentlicht wurde, veröffentlichten die Zentren für die Kontrolle und Prävention von Krankheiten neue Richtlinien, die besagen, dass vollständig geimpfte Menschen in den meisten Innenräumen keine Masken tragen müssen, abgesehen von bestimmten Orten wie Krankenhäusern, Pflegeheimen, Gefängnissen und öffentlichen Verkehrsmitteln. Die Agentur aktualisierte auch frühere Richtlinien zur Maskierung im Freien und sagte, geimpfte Personen ajanta pharma kamagra preis müssen keine Masken tragen, wenn sie drauÃen sind, unabhängig von der GröÃe der Menschenmenge., Die neuesten Empfehlungen könnten mehr Amerikaner dazu anregen, sich impfen zu lassen, aber sie dürften die Debatte darüber anregen, ob der Schritt verfrüht ist. Immungeschwächte Menschen sollten ihre Ãrzte konsultieren, bevor sie maskenlos werden, sagte CDC-Direktorin Rochelle Walensky in einem Briefing des WeiÃen Hauses, in dem sie die neuen Leitlinien ankündigte.
Viele geimpfte Menschen können entscheiden, ihre Maske auf zu halten, und sie sollten nicht kritisiert werden, sagte Anthony Fauci, der PräsidentâÂÂs Chief Medical Adviser, bei der Pressekonferenz. Unter Berufung auf das extrem geringe Risiko einer erectile dysfunction treatment-Ãbertragung im Freien, ajanta pharma kamagra preis die USA, Zentren für die Kontrolle und Prävention von Krankheiten haben angekündigt, dass vollständig geimpfte Menschen keine Masken tragen müssen, wenn sie in kleinen Gruppen von Freunden oder der Familie drauÃen sind. Die CDC empfiehlt weiterhin Outdoor-Maskierung für ungeimpfte (oder teilweise geimpfte) Individuenâ " und für vollständig geimpfte Menschen bei groÃen Versammlungen im Freien wie Sportveranstaltungen oder KonzerteâÂ", bis eine weit verbreitete Impfung erreicht ist. Die neue Anleitung erkennt etwas an, was viele Experten für die Ãbertragung von Viren in der Luft seit ajanta pharma kamagra preis Monaten sagen.
Das Risiko, an erectile dysfunction treatment zu erkranken, ist im Freien viel geringer als in Innenräumen., Die Impfung reduziert dieses Risiko noch mehr. ÃÂÅThe Beispiele zeigen heute, dass, wenn Sie vollständig geimpft sind, können Sie zu vielen Aktivitäten safelyâ ⬠zurückkehren und die meisten von ihnen im Freien und unmaskedâ " und beginnen wieder normal zu bekommen,âÂÂ, sagte CDC-Direktor Rochelle Walensky in einer Pressekonferenz über die neue Führung am Dienstag. Experten begrüÃten ajanta pharma kamagra preis die Ankündigung positiv. à ⬠ÅChanges in den Richtlinien für Outdoor-Maskierung sind willkommen, weil wir wissen,dass die Ãbertragung im Freien ist viel weniger wahrscheinlich als drinnen, â â sagte Linsey Marr, ein Virginia Tech Engineering Professor mit Expertise in Aerosolen, in einer Erklärung., â ⬠ÅThe kamagra breitet sich am häufigsten durch Einatmen aus der Luft, in der Regel von Menschen in der Nähe kommen, oder manchmal weiter weg, wenn Sie in einem schlecht belüfteten Raum sind.
Im Freien kann sich das kamagra nicht in der Luft ajanta pharma kamagra preis ansammeln. Es wird schnell in der Atmosphäre wie ein Farbstofftropfen im Ozean verdünnt.â Marr bemerkte, dass die Führung etwas verwirrend ist, jedoch., Es sagt, dass, wenn Sie geimpft sind, müssen Sie nicht eine Maske tragen, um an kleinen Versammlungen im Freien mit Freunden zu nehmen, die ungeimpftenâÂÂaber es schlägt auch vor, dass ungeimpfte Menschen eine Maske in Versammlungen von geimpften und ungeimpften Menschen tragen sollten. Darüber hinaus sagt die CDC, dass geimpfte Menschen mit Freunden aus anderen Haushalten in einem Restaurant im Freien speisen können, aber Marr fügte hinzu, dass diese Freunde, wenn sie nicht geimpft sind, nicht zusammen essen sollten., Zu Beginn der Pandemie glaubten viele Gesundheitsbehörden, dass das kamagra in erster Linie durch Kontakt mit Oberflächen (technisch fomites genannt) oder durch relativ groÃe Tröpfchen verbreitet, die auf den Boden fallen, anstatt durch aerosolsâÂÂextrem winzige Tröpfchen, die in der Luft suspendiert bleiben. Aber es gibt jetzt eine Fülle von Beweisen dafür, dass sich das kamagra zumindest ajanta pharma kamagra preis teilweise (und vielleicht sogar hauptsächlich) durch die Luft ausbreitet.
Eine kürzlich von der Weltgesundheitsorganisation finanzierte Preprint-Studie deutete auf einen Mangel an festen Schlussfolgerungen zur Ãbertragung von erectile dysfunction in der Luft hin, dem kamagra, das erectile dysfunction treatment verursacht., Als Reaktion darauf veröffentlichte eine Gruppe von Wissenschaftlern und Forschern ein Papier in the Lancet, in dem 10 Faktoren aufgeführt waren, die die Idee der Verbreitung in der Luft unterstützen. Unter ihnen war das viel gröÃere Risiko der Ãbertragung drinnen im Vergleich im Freien. Mit der neuen CDC-Anleitung können geimpfte Menschen maskenlos aufatmen, dass sie ajanta pharma kamagra preis zu einem gewissen Anschein von Normalität zurückkehren können. Aber die Pandemie ist noch nicht vorbei.
Laut Marr ist die Outdoor-Maskierung bei geimpften Menschen in bestimmten ajanta pharma kamagra preis Situationen immer noch wichtig, z. B. Wenn Sie in einer groÃen Linie stehen oder an einer Sportveranstaltung teilnehmen., Sie fügte hinzu, dass sie in jedem Outdoor-face-to-Face-Gespräche länger als eine schnelle âÂÅHow sind Sie maskieren würde empfehlen?. Um zu verfolgen, wann Sie eine Maske ajanta pharma kamagra preis tragen sollten, empfahl Marr, einer âÂÅtwo-out-of-Three-Regel zu folgen.
DrauÃen sein, maskieren und distanzieren. Wenn Sie also im Freien sind, sollten Sie entweder Abstand zu anderen Personen halten ajanta pharma kamagra preis oder eine Maske tragen. Dies gilt sowohl für ungeimpfte als auch für teilweise geimpfte Personen und für alle, die vollständig geimpft sind, sich jedoch in einer gefährdeten Gruppe befinden. ÃÂÅThose, die vollständig geimpft und gesund sind, haben ein wenig mehr Spielraum, â Marr sagte., Aber sie empfahl immer noch, eine Maske um Menschenmengen und Fremde zu tragen.
Es wäre toll, wenn wir nur âÂÅflip einen switchâ ⢠und wieder normal, aber zu ajanta pharma kamagra preis schnell tun riskiert nur mehr erectile dysfunction treatment-Fälle und Todesfälle, sagte Marr. à ⬠ÅWe müssen eine Zeit der allmählichen Aufhebung der VorsichtsmaÃnahmen tolerieren, wie wir in Richtung einer neuen Normalität navigieren.â Lesen Sie hier mehr über den Ausbruch des erectile dysfunction von Scientific American. Und lesen Sie hier Berichterstattung aus unserem internationalen Magazinnetzwerk..
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Im Freien kann sich niedrigster preis kamagra das kamagra nicht in der Luft ansammeln. Es wird schnell in der Atmosphäre wie ein Farbstofftropfen im Ozean verdünnt.â Marr bemerkte, dass die Führung etwas verwirrend ist, jedoch., Es sagt, dass, wenn Sie geimpft sind, müssen Sie nicht eine Maske tragen, um an kleinen Versammlungen im Freien mit Freunden zu nehmen, die ungeimpftenâÂÂaber es schlägt auch vor, dass ungeimpfte Menschen eine Maske in Versammlungen von geimpften und ungeimpften Menschen tragen sollten. Darüber hinaus sagt die CDC, dass geimpfte Menschen mit Freunden aus anderen Haushalten in einem Restaurant im Freien speisen können, aber Marr fügte hinzu, dass diese Freunde, wenn sie nicht geimpft sind, nicht zusammen essen sollten., Zu Beginn der Pandemie glaubten viele Gesundheitsbehörden, dass das kamagra in erster Linie durch Kontakt mit Oberflächen (technisch fomites genannt) oder durch relativ groÃe Tröpfchen verbreitet, die auf den Boden fallen, anstatt durch aerosolsâÂÂextrem winzige Tröpfchen, die in der Luft suspendiert bleiben.
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Mit der neuen CDC-Anleitung können geimpfte Menschen maskenlos aufatmen, dass sie niedrigster preis kamagra zu einem gewissen Anschein von Normalität zurückkehren können. Aber die Pandemie ist noch nicht vorbei. Laut Marr niedrigster preis kamagra ist die Outdoor-Maskierung bei geimpften Menschen in bestimmten Situationen immer noch wichtig, z.
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DrauÃen sein, maskieren und distanzieren. Wenn Sie niedrigster preis kamagra also im Freien sind, sollten Sie entweder Abstand zu anderen Personen halten oder eine Maske tragen. Dies gilt sowohl für ungeimpfte als auch für teilweise geimpfte Personen und für alle, die vollständig geimpft sind, sich jedoch in einer gefährdeten Gruppe befinden.
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Sehr oft arenâÂÂT Menschen bewusst Hörverlust arenââ¬, weil kamagra oral jelly lieferung am nächsten tag es langsam über http://www.businessmattersnj.com/tip-3-i-cant-hear-you/ eine Angelegenheit von Jahren Auftritt. Die Zeichen können subtleâÂÂSie halten, um den Fernseher aufdrehen, oder Sie kämpfen, um Ihre Enkelkinder zu hören. Auch nach der Diagnose warten die Menschen durchschnittlich 10 Jahre, um tatsächlich die Hörgeräte thatâÂÂll Ihnen helfen, besser zu kamagra oral jelly lieferung am nächsten tag hören.
ThatâÂÂs ein Fehler thatâÂÂs am besten vermieden, da nicht Hörbehinderung zu behandeln kann in auditive deprivationâÂÂund im Laufe der Zeit führen, können die Teile des Gehirns verantwortlich für das hören schrumpfen oder verkümmern aus Mangel an Nutzung., Ja, Sie haben richtig gelesen. Eine Schrumpfung des Gehirns kann auftreten, wenn Sie Ihren Hörverlust nicht behandeln. Was ist auditive deprivation? kamagra oral jelly lieferung am nächsten tag.
Auditive deprivation tritt auf, wenn Ihrem Gehirn Schall entzogen wird, Z. B. Durch unbehandelten Hörverlust.
Mit der Zeit verliert Ihr Gehirn die Fähigkeit, Schall zu verarbeiten. Unbehandelt werden die Teile des Gehirns, die normalerweise für das hören verantwortlich sind, anderen Aufgaben "zugewiesen". Diese Teile neigen auch dazu, zu schrumpfen oder zu verkümmern.
Es kann jeden mit Hörverlust betreffen, nicht nur schwere Fälle., âÂÅAuditory deprivation ist, wenn das Gehirn Schwierigkeiten hat, Informationen zu verstehen und zu verarbeiten aufgrund des Mangels an stimulation, â sagte Audiologe Jenilee P. Pulido, AuD, von HearCare Audiology Center in Sarasota, Fla. Hirnatrophie durch unbehandelten Hörverlust denken Sie daran.
Hören ist eine Gehirnaktivität (manchmal auch als "gehirnhören"bezeichnet). Ihre Ohren liefern Schall als elektrische Impulse über den Hörnerv, aber itâÂÂs in Ihrem Gehirn, dass diese elektrischen Impulse in das übersetzt werden, was wir als Klang erkennen., Wenn weniger Geräusche zum Gehirn gelangen, reagiert das Gehirn, indem es seine Funktionsweise ändert. Selbst bei nur geringem Hörverlust können die Teile Ihres Gehirns, die mit der auditiven Verarbeitung umgehen, laut einer Studie von 2014 stattdessen auf visuelle Verarbeitung umsteigen.
Andere negative Veränderungen in Ihrem Gehirn können ebenfalls auftreten, und selbst nach dem Erhalt von Hörgeräten kann die Verarbeitung von Geräuschen eine Herausforderung darstellen. Wenn Sie den Hörverlust zu lange unbehandelt lassen, können die auditiven Teile Ihres Gehirns anderen Funktionen "zugewiesen" werden., Dies kann die Behandlung von Hörverlust mit Standardbehandlungen wie Hörgeräten erschweren. Audiologen nennen dieses Phänomen " benutze es oder verliere es."Verwenden Sie es oder verlieren.
Hörverlust und Gehirnfunktion Sprechen Sie mit Audiologen über das hören, und thereâÂÂs eine phrase, die youâÂÂll immer wieder hören. Verwenden Sie es oder verlieren. âÂÅThe länger Sie warten, um eine Behandlung zu suchen, desto [mehr] Gehirn hat Probleme,Informationen zu verstehen und zu verarbeiten, â sagt Pulido, der ein fellow der American Academy of Audiology ist., Das heiÃt, Sie können âÂÅhearâ ⢠die Geräusche von jemandem sprechen, aber Ihr Gehirn wird kämpfen, um die tatsächlichen Worte zu verstehen, verwendet wird.
Manche Menschen haben das Gefühl, einen kognitiven Verfall zu haben, wenn es wirklich nur um Hörverlust geht. Ist auditive deprivation dauerhaft?. ItâÂÂs unklar, ob die zerebrale Atrophie dauerhaft ist oder nicht, und es variiert wahrscheinlich von person zu person.
Insgesamt aber das "Gehirn ist sehr [flexibel] und es kann eine Menge changesâ ⬠machen" sobald itâÂÂs angeregt wird, können neue verbindungen bilden, so dass es mehr Informationen verstehen kann,sagt Pulido., Eine kleine Studie ergab, dass das tragen von Hörgeräten â ⬠Åmay kompensatorische Veränderungen in der kortikalen Ressourcen allocationâÂÂâ " mit anderen Worten, negative Veränderungen in Ihrem Gehirn kann mit konsequenter Verwendung von Hörgeräten verbessern. Die Schrumpfung des Gehirns kann sich verlangsamen oder stoppen, und Ihr Gehirn kann wieder Tonsignale aufnehmen. Ursachen von hörentzug eine häufige Art, wie Menschen hörentzug entwickeln, ist die Vermeidung einer Behandlung mit Hörverlust.
Wenn beispielsweise Hörgeräte in Ihrem Fall (und nicht in Ihren Ohren) verbleiben, kann dies zu hörentzug führen., â ⬠ÅThis kommt vor allem, wenn jemand einen diagnostizierten Hörverlust hat und Sie donâÂÂT behandeln,dass Hörverlust, â pulido sagt. ÃÂÅOver die Zeit nicht bekommen, dass auditive stimulation, die Verbindung zwischen den Ohren und dem Gehirn schwach wird."Der Hörnerv beginnt zu verkümmern und zu Schwächen, sagt Sie. Ein weiterer Grund, warum es auftreten kann, ist, wenn Menschen Hörverlust in beiden Ohren haben, aber nur ein Hörgerät auf einem Ohr tragen, sagt Sie.
Warum zwei Hörgeräte wichtig sind Menschen können für ein einziges Hörgerät entscheiden, weil Sie denken, itâÂÂs weniger Auffällig oder finden es bequemer., Aber oft, sagt Pulido, itâÂÂs wegen des Preises von Hörgeräten. Unabhängig von dem Grund, mit einem hörgeräteâ " wenn beide Ohren hören lossâÂÂwird einen negativen Einfluss haben. âÂÅThe eine Seite, die das Hörgerät trägt schön und stark bleiben, aber die andere Seite, die isnâÂÂT mit einem Hörgerät behandelt wird, kann schwach werden und beginnen zu verkümmern mehr als die andere Seite thatâÂÂs Hilfe bekommen,âÂ?.
pulido sagt., Mehr. Warum zwei Hörgeräte sind besser Als ein Hörverlust kann auch durch Hörgeräte verursacht werden, die donâÂÂT gut passen oder arenâÂÂT programmiert properlyâ " thatâÂÂs einer der Gründe itâÂÂs Schlüssel zu follow-up mit Ihrem Audiologen oder Hörgeräteakustiker, wenn Sie Ihre Hörgeräte hassen. Denken Sie daran, dass Hörgeräte auf Ihren einzigartigen Hörverlust zugeschnitten sind und weitaus komplexer sind als Brillen.
Möglicherweise benötigen Sie mehr als einen Bürobesuch, um herauszufinden, wie Sie Sie richtig verwenden. AuÃerdem ändert sich Ihr Gehör im Laufe der Zeit, also halten Sie mit Ihren hörgeräterminen Schritt., Die Anpassung des Hörgeräts kann eine Weile dauern einige Geduld ist mit Hörgeräten erforderlich. Im Gegensatz zu Gläsern, wo youâÂÂll gut sein, von fast dem moment zu gehen, Sie Sie auf gleiten, auf die Wiederherstellung des Klangs gewöhnen kann ein allmählicher Prozess sein, sagt Pulido.
ItâÂÂs auch anders für everyoneâ " einige Menschen akklimatisieren in Tagen oder Wochen, während andere länger dauern. Das anlegen von Hörgeräten kann einige Anpassungen erfordern, insbesondere wenn es eine Weile her ist, seit Ihr Gehör mit voller Wucht war., âÂÅThe häufigste Art von Hörverlust ist langsam und gradualâ " so gewöhnen Sie sich daran, und denken, itâÂÂs normal, so zu hören, â pulido weist darauf hin. Dein Gehirn gewöhnt sich auch daran.
Wenn die Hörgeräte eingeschaltet sind, können Geräusche in Ihrer Umgebung (wie das Summen der Spülmaschine oder des Kühlschranks) laut erscheinen, ebenso wie der Klang Ihrer eigenen Stimme, sagt Pulido. HereâÂÂs die gute Nachricht. Mit der Zeit, youâÂÂll anpassen.
â ⬠ÅOver Zeit, wenn Sie die Geräte konsequent tragen, wird das Gehirn an den Klang gewöhnt und akklimatisiert,â â pulido sagt., Aber etwas Geduld ist requiredâÂÂim Gegensatz zu Gläsern, wo youâÂÂll gut sein, von fast dem moment zu gehen, Sie Sie auf gleiten, auf die Wiederherstellung des Klangs gewöhnen kann ein allmählicher Prozess sein, sagt Pulido. ItâÂÂs auch anders für everyoneâ " einige Menschen akklimatisieren in Tagen oder Wochen, während andere länger dauern. Sobald Sie sich angepasst haben, vermeiden Sie die Einnahme von "Hörgeräten"."Tragen Sie Ihre Hörgeräte den ganzen Tag, auch wenn Sie alleine zu Hause sind.
Dies hält Ihr hearingâ " und Ihr brainâÂÂscharf., Verhindern Sie hörentzug bevor es beginnt natürlich ist der beste Weg, um zu vermeiden, dass hörentzug Auftritt, proaktiv zu sein, wenn es um Ihr Gehör geht. Die American Speech-Language-Hearing Association (ASHA) empfiehlt Erwachsenen, alle 10 Jahre bis zum Alter von 50 Jahren und danach alle drei Jahre ein Hörscreening durchzuführen. â ⬠ÅWe empfehlen, dass jeder über 50 ein Hörscreening oder eine Diagnose Bewertung bekommen, ob Sie Hörprobleme haben oder nicht, â ŠPulido sagt., Es hat sich gezeigt, dass sogar ein leichter Hörverlust das Verständnis und die Verarbeitung beeinflusst und mit einem Rückgang der Kognition zusammenhängt, stellt Pulido fest.
MäÃiger bis schwerer Hörverlust ist mit Demenz verbunden. âÂÅItâÂÂs so wichtig, einen Hörtest früh zu bekommen, â sagt Sie.Die Entscheidung, eine Hormontherapie (HT) einzunehmen, um Symptome der menopause zu zähmen, kann Komplex sein. Es gibt Vorteile und Risiken, die Sie mit Ihrem Arzt abwägen müssen.
Ein Bereich der aufkommenden Forschung ist die Beziehung zwischen Hörverlust, menopause und Hormontherapie. Forscher finden immer noch heraus, wie sich die menopause auf das Gehör auswirkt., Gleiches gilt für HT. Untersuchungen mit Mäusen und vorläufige Studien am Menschen legen nahe, dass die Einnahme von östrogen schützende Auswirkungen auf Ihr Gehör haben kann.
Eine Analyse mit dem bisher gröÃten Datenpool zum Thema ergab jedoch tatsächlich das Gegenteil. Bisher haben Studien ähnliche Ergebnisse erbracht, bei denen die Auswirkungen von Hormonen auf den Hörverlust untersucht wurden. Wenn Sie derzeit keinen Hörverlust haben, könnte HT Ihr Risiko erhöhen, so ein team unter der Leitung von Dr.
Sharon Curhan, MD, einem Arzt und Epidemiologen am Brigham and WomenâÂÂs Hospital in Boston., Dies galt sowohl für Pillen und Pflaster als auch für Formeln mit östrogen nur oder in Kombination mit Progesteron. Um auf die zahlen herunterzukommen. Wenn CurhanâÂÂs team Daten für mehr als 47.000 Krankenschwestern 22 Jahre lang analysiert spanning, kamen Sie zu dem Schluss, dass ein Kurs von HT für fünf bis zehn Jahre das Risiko einer Frau von Hörverlust um 15 Prozent erhöht im Vergleich zu einer Frau, die HT nicht nimmt.
Das Risiko stieg, je länger eine Frau auf HT blieb. Die Analyse ergab auch, dass Frauen, die sich in den Wechseljahren in einem höheren Alter Unterziehen, ein höheres Risiko für Hörverlust haben., Wie hören und menopause zusammenhängen YouâÂÂve wahrscheinlich gehört, dass östrogentropfen Symptome wie Hitzewallungen auslösen können. Ãstrogen, ein Hormon, spielt eine Rolle im ganzen bodyâ " in Ihren Muskeln und Knochen, Herz und Gehirn sowie Fortpflanzungssystem.
Wissenschaftler wissen, dass wir östrogenrezeptoren in ohrzellen und in hörwegen haben, aber itâÂÂs noch nicht genau bekannt, wie östrogen das hören beeinflusst. Der sexualhormonspiegel ändert sich während eines Menstruationszyklus, und während der menstruation kann Ihr Gehör weniger empfindlich werden., Während perimenopauseâ "die Jahre, bevor Ihre Eierstöcke aufhören, Eier freizusetzen und Ihre Periode endsâÂ" Ihre Eierstöcke produzieren allmählich weniger östrogen. In den letzten ein bis zwei Jahren der perimenopause beschleunigt sich der östrogenabfall.
Nach dem Ende Ihrer Periode, typischerweise nach dem 45. Lebensjahr, produzieren die Eierstöcke wenig östrogen, aber Sie bekommen immer noch etwas von Ihren Nebennieren und Fettgewebe. Wie CurhanâÂÂs team berichtet, haben sowohl menschliche als auch Tierische Studien gezeigt, dass niedrige östrogenspiegel das Gehör beeinträchtigen können, möglicherweise durch Veränderungen des Blutflusses zur cochlea, dem hohlrohr im Innenohr., Eine separate Studie, in der Hör-und Blutspiegel von östradiol (eine Form von östrogen) bei 1.830 Frauen nach der Menopause gemessen wurden, ergab, dass die Probanden mit weniger östradiol eher Hörverlust hatten.
Ein weiteres wichtiges fortpflanzungshormon, Progesteron, beginnt in den DreiÃigern zu sinken. Progesteron, das Schwangerschaft reguliert, ist das yin zu östrogenâÂÂs yang. Es reduziert Rezeptorzellen für östrogen.
Progesteron doesnâÂÂt die cochlea direkt beeinflussen, aber es könnte durch östrogenrezeptoren und damit den Blutfluss zum Ohr zu reduzieren. Beeinflusst das Alter in den Wechseljahren Ihr Gehör?. , Der Zusammenhang zwischen niedrigem östrogenspiegel und Hörstörungen legt nahe, dass Frauen, die später in den Wechseljahren ankommen, bei 50 oder olderâ "51 ist das Durchschnittsalter der menopause in den Vereinigten StaatenâÂ" könnte ein geringeres Risiko für Hörverlust haben.
SchlieÃlich wäre es sinnvoll, dass Frauen, die früher in die Wechseljahre kommen, früher östrogentropfen hatten. Als CurhanâÂÂs team sich jedoch einen pool von Daten über fast 81.000 Krankenschwestern ansah, war das Gegenteil der Fall. Frauen mit späten natürlichen Wechseljahren hatten überraschenderweise eine um 10 Prozent höhere chance auf Hörverlust., Der Grund für diesen Befund ist unklar, da wir DonaÂÂt ein vollständiges Bild von allen Faktoren haben, die das Alter der menopause beeinflussen, sagte Dr.
Curhan Gesundes Gehör. Ãberwachen Sie Ihr Gehör, wenn Sie mit der Hormontherapie beginnen Wenn Sie mit der Hormontherapie beginnen möchten Dr. Curhan schlägt vor, Ihr Gehör zu überwachen und HT nur so lange wie nötig einzunehmen.
Einige Frauen haben auf HT mit plötzlichem Hörverlust, tinnitus und Schwindel reagiert. Wenden Sie sich sofort an Ihren Anbieter, wenn Ihnen dies passiert., Wenn youâÂÂre ht erwägen, youâÂÂre wahrscheinlich eine Kombination mit Gestagen angeboten werden (ein Medikament wie Progesteron), wenn Sie noch Ihre Gebärmutter haben. Ãstrogen allein könnte das Wachstum der Gebärmutterschleimhaut stimulieren und erhöht das Risiko von Gebärmutterhalskrebs, so dass es häufiger für Frauen verwendet wird, die eine Hysterektomie hatten.
Wenn Sie sich für HT entscheiden, schlägt Dr. Curhan vor, Ihr Gehör zu überwachen und HT nur so lange wie nötig einzunehmen. Einige Menschen haben auf HT mit plötzlichem Hörverlust, tinnitus und Schwindel reagiert.
Tinnitus, Hormone und menopause Dr., Sharon Curhan die Beziehung zwischen menopause, Hormonersatztherapie und tinnitus Ist ein Thema, das auch mehr untersucht werden muss. Einige Frauen können tinnitus erleben, wenn Sie eine Hormontherapie für die perimenopause beginnen. Studien haben jedoch auch gezeigt, dass eine Hormontherapie die tinnitusrate bei perimenopausalen Frauen tatsächlich senken kann.
âÂÅWe freuen uns mehr über Risikofaktoren für tinnitus zu verstehen, â ŠDr. Curhan sagte Gesundes Gehör. Sie studiert Ihre Beziehung zu den Wechseljahren und HT.
Was können Frauen also tun, um Ihr Gehör zu schützen?. , Diät, Bewegung und Aufrechterhaltung eines gesunden Gewichts zählen. ÃÂÅWe fanden heraus, dass Menschen, die Diäten aÃen, die am ähnlichsten das Mittelmeer oder DASH [Diätetische Ansätze Zur Bluthochdruck zu Stoppen] Muster hatten ein wesentlich geringeres Risiko für Hörverlust, â ŠDr.
Curhan sagte. Das bedeutet, mehr Fisch, Gemüse und Vollkornprodukte zu Essen und weniger Fleisch und junk food. Mehr.
Wie eine gesunde Ernährung Ihrem Gehör hilft. Achten Sie auch auf Medikamente im Zusammenhang mit Hörverlust., CurhanâÂÂs Forschung mit dem gleichen big-data-pool fand heraus, dass die Verwendung der rezeptfreien Schmerzmittel ibuprofen und paracetamol zwei oder mehr mal pro Woche zu Hörverlust verbunden sein kann (aspirin ist OK). Aber es gab keine Bindung zu Alkohol.
SchlieÃlich sollten Sie sich von lauten oder Konstanten Hintergrundgeräuschen fernhalten, Ihr Gehör überprüfen lassen und regelmäÃig vorgeschriebene Hörgeräte tragen, und Sie wissen, dass Sie mit zunehmendem Alter Ihr bestes getan haben, um Hörverlust zu verhindern..
Sehr oft arenâÂÂT Menschen bewusst Hörverlust arenââ¬, weil es kamagra pillen zu verkaufen langsam über eine Angelegenheit von Jahren Auftritt niedrigster preis kamagra. Die Zeichen können subtleâÂÂSie halten, um den Fernseher aufdrehen, oder Sie kämpfen, um Ihre Enkelkinder zu hören. Auch nach der Diagnose niedrigster preis kamagra warten die Menschen durchschnittlich 10 Jahre, um tatsächlich die Hörgeräte thatâÂÂll Ihnen helfen, besser zu hören. ThatâÂÂs ein Fehler thatâÂÂs am besten vermieden, da nicht Hörbehinderung zu behandeln kann in auditive deprivationâÂÂund im Laufe der Zeit führen, können die Teile des Gehirns verantwortlich für das hören schrumpfen oder verkümmern aus Mangel an Nutzung., Ja, Sie haben richtig gelesen. Eine Schrumpfung des Gehirns kann auftreten, wenn Sie Ihren Hörverlust nicht behandeln.
Was ist auditive niedrigster preis kamagra deprivation?. Auditive deprivation tritt auf, wenn Ihrem Gehirn Schall entzogen wird, Z. B. Durch unbehandelten Hörverlust. Mit der Zeit verliert Ihr Gehirn die Fähigkeit, Schall zu verarbeiten.
Unbehandelt werden die Teile des Gehirns, die normalerweise für das hören verantwortlich sind, anderen Aufgaben "zugewiesen". Diese Teile neigen auch dazu, zu schrumpfen oder zu verkümmern. Es kann jeden mit Hörverlust betreffen, nicht nur schwere Fälle., âÂÅAuditory deprivation ist, wenn das Gehirn Schwierigkeiten hat, Informationen zu verstehen und zu verarbeiten aufgrund des Mangels an stimulation, â sagte Audiologe Jenilee P. Pulido, AuD, von HearCare Audiology Center in Sarasota, Fla. Hirnatrophie durch unbehandelten Hörverlust denken Sie daran.
Hören ist eine Gehirnaktivität (manchmal auch als "gehirnhören"bezeichnet). Ihre Ohren liefern Schall als elektrische Impulse über den Hörnerv, aber itâÂÂs in Ihrem Gehirn, dass diese elektrischen Impulse in das übersetzt werden, was wir als Klang erkennen., Wenn weniger Geräusche zum Gehirn gelangen, reagiert das Gehirn, indem es seine Funktionsweise ändert. Selbst bei nur geringem Hörverlust können die Teile Ihres Gehirns, die mit der auditiven Verarbeitung umgehen, laut einer Studie von 2014 stattdessen auf visuelle Verarbeitung umsteigen. Andere negative Veränderungen in Ihrem Gehirn können ebenfalls auftreten, und selbst nach dem Erhalt von Hörgeräten kann die Verarbeitung von Geräuschen eine Herausforderung darstellen. Wenn Sie den Hörverlust zu lange unbehandelt lassen, können die auditiven Teile Ihres Gehirns anderen Funktionen "zugewiesen" werden., Dies kann die Behandlung von Hörverlust mit Standardbehandlungen wie Hörgeräten erschweren.
Audiologen nennen dieses Phänomen " benutze es oder verliere es."Verwenden Sie es oder verlieren. Hörverlust und Gehirnfunktion Sprechen Sie mit Audiologen über das hören, und thereâÂÂs eine phrase, die youâÂÂll immer wieder hören. Verwenden Sie es oder verlieren. âÂÅThe länger Sie warten, um eine Behandlung zu suchen, desto [mehr] Gehirn hat Probleme,Informationen zu verstehen und zu verarbeiten, â sagt Pulido, der ein fellow der American Academy of Audiology ist., Das heiÃt, Sie können âÂÅhearâ ⢠die Geräusche von jemandem sprechen, aber Ihr Gehirn wird kämpfen, um die tatsächlichen Worte zu verstehen, verwendet wird. Manche Menschen haben das Gefühl, einen kognitiven Verfall zu haben, wenn es wirklich nur um Hörverlust geht.
Ist auditive deprivation dauerhaft?. ItâÂÂs unklar, ob die zerebrale Atrophie dauerhaft ist oder nicht, und es variiert wahrscheinlich von person zu person. Insgesamt aber das "Gehirn ist sehr [flexibel] und es kann eine Menge changesâ ⬠machen" sobald itâÂÂs angeregt wird, können neue verbindungen bilden, so dass es mehr Informationen verstehen kann,sagt Pulido., Eine kleine Studie ergab, dass das tragen von Hörgeräten â ⬠Åmay kompensatorische Veränderungen in der kortikalen Ressourcen allocationâÂÂâ " mit anderen Worten, negative Veränderungen in Ihrem Gehirn kann mit konsequenter Verwendung von Hörgeräten verbessern. Die Schrumpfung des Gehirns kann sich verlangsamen oder stoppen, und Ihr Gehirn kann wieder Tonsignale aufnehmen. Ursachen von hörentzug eine häufige Art, wie Menschen hörentzug entwickeln, ist die Vermeidung einer Behandlung mit Hörverlust.
Wenn beispielsweise Hörgeräte in Ihrem Fall (und nicht in Ihren Ohren) verbleiben, kann dies zu hörentzug führen., â ⬠ÅThis kommt vor allem, wenn jemand einen diagnostizierten Hörverlust hat und Sie donâÂÂT behandeln,dass Hörverlust, â pulido sagt. ÃÂÅOver die Zeit nicht bekommen, dass auditive stimulation, die Verbindung zwischen den Ohren und dem Gehirn schwach wird."Der Hörnerv beginnt zu verkümmern und zu Schwächen, sagt Sie. Ein weiterer Grund, warum es auftreten kann, ist, wenn Menschen Hörverlust in beiden Ohren haben, aber nur ein Hörgerät auf einem Ohr tragen, sagt Sie. Warum zwei Hörgeräte wichtig sind Menschen können für ein einziges Hörgerät entscheiden, weil Sie denken, itâÂÂs weniger Auffällig oder finden es bequemer., Aber oft, sagt Pulido, itâÂÂs wegen des Preises von Hörgeräten. Unabhängig von dem Grund, mit einem hörgeräteâ " wenn beide Ohren hören lossâÂÂwird einen negativen Einfluss haben.
âÂÅThe eine Seite, die das Hörgerät trägt schön und stark bleiben, aber die andere Seite, die isnâÂÂT mit einem Hörgerät behandelt wird, kann schwach werden und beginnen zu verkümmern mehr als die andere Seite thatâÂÂs Hilfe bekommen,âÂ?. pulido sagt., Mehr. Warum zwei Hörgeräte sind besser Als ein Hörverlust kann auch durch Hörgeräte verursacht werden, die donâÂÂT gut passen oder arenâÂÂT programmiert properlyâ " thatâÂÂs einer der Gründe itâÂÂs Schlüssel zu follow-up mit Ihrem Audiologen oder Hörgeräteakustiker, wenn Sie Ihre Hörgeräte hassen. Denken Sie daran, dass Hörgeräte auf Ihren einzigartigen Hörverlust zugeschnitten sind und weitaus komplexer sind als Brillen. Möglicherweise benötigen Sie mehr als einen Bürobesuch, um herauszufinden, wie Sie Sie richtig verwenden.
AuÃerdem ändert sich Ihr Gehör im Laufe der Zeit, also halten Sie mit Ihren hörgeräterminen Schritt., Die Anpassung des Hörgeräts kann eine Weile dauern einige Geduld ist mit Hörgeräten erforderlich. Im Gegensatz zu Gläsern, wo youâÂÂll gut sein, von fast dem moment zu gehen, Sie Sie auf gleiten, auf die Wiederherstellung des Klangs gewöhnen kann ein allmählicher Prozess sein, sagt Pulido. ItâÂÂs auch anders für everyoneâ " einige Menschen akklimatisieren in Tagen oder Wochen, während andere länger dauern. Das anlegen von Hörgeräten kann einige Anpassungen erfordern, insbesondere wenn es eine Weile her ist, seit Ihr Gehör mit voller Wucht war., âÂÅThe häufigste Art von Hörverlust ist langsam und gradualâ " so gewöhnen Sie sich daran, und denken, itâÂÂs normal, so zu hören, â pulido weist darauf hin. Dein Gehirn gewöhnt sich auch daran.
Wenn die Hörgeräte eingeschaltet sind, können Geräusche in Ihrer Umgebung (wie das Summen der Spülmaschine oder des Kühlschranks) laut erscheinen, ebenso wie der Klang Ihrer eigenen Stimme, sagt Pulido. HereâÂÂs die gute Nachricht. Mit der Zeit, youâÂÂll anpassen. â ⬠ÅOver Zeit, wenn Sie die Geräte konsequent tragen, wird das Gehirn an den Klang gewöhnt und akklimatisiert,â â pulido sagt., Aber etwas Geduld ist requiredâÂÂim Gegensatz zu Gläsern, wo youâÂÂll gut sein, von fast dem moment zu gehen, Sie Sie auf gleiten, auf die Wiederherstellung des Klangs gewöhnen kann ein allmählicher Prozess sein, sagt Pulido. ItâÂÂs auch anders für everyoneâ " einige Menschen akklimatisieren in Tagen oder Wochen, während andere länger dauern.
Sobald Sie sich angepasst haben, vermeiden Sie die Einnahme von "Hörgeräten"."Tragen Sie Ihre Hörgeräte den ganzen Tag, auch wenn Sie alleine zu Hause sind. Dies hält Ihr hearingâ " und Ihr brainâÂÂscharf., Verhindern Sie hörentzug bevor es beginnt natürlich ist der beste Weg, um zu vermeiden, dass hörentzug Auftritt, proaktiv zu sein, wenn es um Ihr Gehör geht. Die American Speech-Language-Hearing Association (ASHA) empfiehlt Erwachsenen, alle 10 Jahre bis zum Alter von 50 Jahren und danach alle drei Jahre ein Hörscreening durchzuführen. â ⬠ÅWe empfehlen, dass jeder über 50 ein Hörscreening oder eine Diagnose Bewertung bekommen, ob Sie Hörprobleme haben oder nicht, â ŠPulido sagt., Es hat sich gezeigt, dass sogar ein leichter Hörverlust das Verständnis und die Verarbeitung beeinflusst und mit einem Rückgang der Kognition zusammenhängt, stellt Pulido fest. MäÃiger bis schwerer Hörverlust ist mit http://half-witpoet.com/?p=8 Demenz verbunden.
âÂÅItâÂÂs so wichtig, einen Hörtest früh zu bekommen, â sagt Sie.Die Entscheidung, eine Hormontherapie (HT) einzunehmen, um Symptome der menopause zu zähmen, kann Komplex sein. Es gibt Vorteile und Risiken, die Sie mit Ihrem Arzt abwägen müssen. Ein Bereich der aufkommenden Forschung ist die Beziehung zwischen Hörverlust, menopause und Hormontherapie. Forscher finden immer noch heraus, wie sich die menopause auf das Gehör auswirkt., Gleiches gilt für HT. Untersuchungen mit Mäusen und vorläufige Studien am Menschen legen nahe, dass die Einnahme von östrogen schützende Auswirkungen auf Ihr Gehör haben kann.
Eine Analyse mit dem bisher gröÃten Datenpool zum Thema ergab jedoch tatsächlich das Gegenteil. Bisher haben Studien ähnliche Ergebnisse erbracht, bei denen die Auswirkungen von Hormonen auf den Hörverlust untersucht wurden. Wenn Sie derzeit keinen Hörverlust haben, könnte HT Ihr Risiko erhöhen, so ein team unter der Leitung von Dr. Sharon Curhan, MD, einem Arzt und Epidemiologen am Brigham and WomenâÂÂs Hospital in Boston., Dies galt sowohl für Pillen und Pflaster als auch für Formeln mit östrogen nur oder in Kombination mit Progesteron. Um auf die zahlen herunterzukommen.
Wenn CurhanâÂÂs team Daten für mehr als 47.000 Krankenschwestern 22 Jahre lang analysiert spanning, kamen Sie zu dem Schluss, dass ein Kurs von HT für fünf bis zehn Jahre das Risiko einer Frau von Hörverlust um 15 Prozent erhöht im Vergleich zu einer Frau, die HT nicht nimmt. Das Risiko stieg, je länger eine Frau auf HT blieb. Die Analyse ergab auch, dass Frauen, die sich in den Wechseljahren in einem höheren Alter Unterziehen, ein höheres Risiko für Hörverlust haben., Wie hören und menopause zusammenhängen YouâÂÂve wahrscheinlich gehört, dass östrogentropfen Symptome wie Hitzewallungen auslösen können. Ãstrogen, ein Hormon, spielt eine Rolle im ganzen bodyâ " in Ihren Muskeln und Knochen, Herz und Gehirn sowie Fortpflanzungssystem. Wissenschaftler wissen, dass wir östrogenrezeptoren in ohrzellen und in hörwegen haben, aber itâÂÂs noch nicht genau bekannt, wie östrogen das hören beeinflusst.
Der sexualhormonspiegel ändert sich während eines Menstruationszyklus, und während der menstruation kann Ihr Gehör weniger empfindlich werden., Während perimenopauseâ "die Jahre, bevor Ihre Eierstöcke aufhören, Eier freizusetzen und Ihre Periode endsâÂ" Ihre Eierstöcke produzieren allmählich weniger östrogen. In den letzten ein bis zwei Jahren der perimenopause beschleunigt sich der östrogenabfall. Nach dem Ende Ihrer Periode, typischerweise nach dem 45. Lebensjahr, produzieren die Eierstöcke wenig östrogen, aber Sie bekommen immer noch etwas von Ihren Nebennieren und Fettgewebe. Wie CurhanâÂÂs team berichtet, haben sowohl menschliche als auch Tierische Studien gezeigt, dass niedrige östrogenspiegel das Gehör beeinträchtigen können, möglicherweise durch Veränderungen des Blutflusses zur cochlea, dem hohlrohr im Innenohr., Eine separate Studie, in der Hör-und Blutspiegel von östradiol (eine Form von östrogen) bei 1.830 Frauen nach der Menopause gemessen wurden, ergab, dass die Probanden mit weniger östradiol eher Hörverlust hatten.
Ein weiteres wichtiges fortpflanzungshormon, Progesteron, beginnt in den DreiÃigern zu sinken. Progesteron, das Schwangerschaft reguliert, ist das yin zu östrogenâÂÂs yang. Es reduziert Rezeptorzellen für östrogen. Progesteron doesnâÂÂt die cochlea direkt beeinflussen, aber es könnte durch östrogenrezeptoren und damit den Blutfluss zum Ohr zu reduzieren. Beeinflusst das Alter in den Wechseljahren Ihr Gehör?.
, Der Zusammenhang zwischen niedrigem östrogenspiegel und Hörstörungen legt nahe, dass Frauen, die später in den Wechseljahren ankommen, bei 50 oder olderâ "51 ist das Durchschnittsalter der menopause in den Vereinigten StaatenâÂ" könnte ein geringeres Risiko für Hörverlust haben. SchlieÃlich wäre es sinnvoll, dass Frauen, die früher in die Wechseljahre kommen, früher östrogentropfen hatten. Als CurhanâÂÂs team sich jedoch einen pool von Daten über fast 81.000 Krankenschwestern ansah, war das Gegenteil der Fall. Frauen mit späten natürlichen Wechseljahren hatten überraschenderweise eine um 10 Prozent höhere chance auf Hörverlust., Der Grund für diesen Befund ist unklar, da wir DonaÂÂt ein vollständiges Bild von allen Faktoren haben, die das Alter der menopause beeinflussen, sagte Dr. Curhan Gesundes Gehör.
Ãberwachen Sie Ihr Gehör, wenn Sie mit der Hormontherapie beginnen Wenn Sie mit der Hormontherapie beginnen möchten Dr. Curhan schlägt vor, Ihr Gehör zu überwachen und HT nur so lange wie nötig einzunehmen. Einige Frauen haben auf HT mit plötzlichem Hörverlust, tinnitus und Schwindel reagiert. Wenden Sie sich sofort an Ihren Anbieter, wenn Ihnen dies passiert., Wenn youâÂÂre ht erwägen, youâÂÂre wahrscheinlich eine Kombination mit Gestagen angeboten werden (ein Medikament wie Progesteron), wenn Sie noch Ihre Gebärmutter haben. Ãstrogen allein könnte das Wachstum der Gebärmutterschleimhaut stimulieren und erhöht das Risiko von Gebärmutterhalskrebs, so dass es häufiger für Frauen verwendet wird, die eine Hysterektomie hatten.
Wenn Sie sich für HT entscheiden, schlägt Dr. Curhan vor, Ihr Gehör zu überwachen und HT nur so lange wie nötig einzunehmen. Einige Menschen haben auf HT mit plötzlichem Hörverlust, tinnitus und Schwindel reagiert. Tinnitus, Hormone und menopause Dr., Sharon Curhan die Beziehung zwischen menopause, Hormonersatztherapie und tinnitus Ist ein Thema, das auch mehr untersucht werden muss. Einige Frauen können tinnitus erleben, wenn Sie eine Hormontherapie für die perimenopause beginnen.
Studien haben jedoch auch gezeigt, dass eine Hormontherapie die tinnitusrate bei perimenopausalen Frauen tatsächlich senken kann. âÂÅWe freuen uns mehr über Risikofaktoren für tinnitus zu verstehen, â ŠDr. Curhan sagte Gesundes Gehör. Sie studiert Ihre Beziehung zu den Wechseljahren und HT. Was können Frauen also tun, um Ihr Gehör zu schützen?.
, Diät, Bewegung und Aufrechterhaltung eines gesunden Gewichts zählen. ÃÂÅWe fanden heraus, dass Menschen, die Diäten aÃen, die am ähnlichsten das Mittelmeer oder DASH [Diätetische Ansätze Zur Bluthochdruck zu Stoppen] Muster hatten ein wesentlich geringeres Risiko für Hörverlust, â ŠDr. Curhan sagte. Das bedeutet, mehr Fisch, Gemüse und Vollkornprodukte zu Essen und weniger Fleisch und junk food. Mehr.
Wie eine gesunde Ernährung Ihrem Gehör hilft. Achten Sie auch auf Medikamente im Zusammenhang mit Hörverlust., CurhanâÂÂs Forschung mit dem gleichen big-data-pool fand heraus, dass die Verwendung der rezeptfreien Schmerzmittel ibuprofen und paracetamol zwei oder mehr mal pro Woche zu Hörverlust verbunden sein kann (aspirin ist OK). Aber es gab keine Bindung zu Alkohol. SchlieÃlich sollten Sie sich von lauten oder Konstanten Hintergrundgeräuschen fernhalten, Ihr Gehör überprüfen lassen und regelmäÃig vorgeschriebene Hörgeräte tragen, und Sie wissen, dass Sie mit zunehmendem Alter Ihr bestes getan haben, um Hörverlust zu verhindern..
Eine noch unbeantwortete Frage ist, was kamagra oral jelly online shop den kleinen Zithromax online kaufen deutschland Teil der aktivierten keimzentrum (GC) B-Zellen antreibt, langlebige ruhespeicher-B-Zellen zu werden. Wir fanden hier heraus, dass eine kleine population von GC-abgeleiteten CD38intBcl6hi/intEfnb1+ - Zellen kamagra oral jelly online shop mit niedrigerer mTORC1-Aktivität das Schicksal von Speicher-B-Zellen begünstigte. Konstitutiv hohe mTORC1-Aktivität führte zu Defekten bei der Bildung der CD38intBcl6hi / intEfnb1+ - Zellen.
Umgekehrt führte eine abnehmende mTORC1-Aktivität zu einer relativen Anreicherung dieser speicheranfälligen population gegenüber kamagra oral jelly online shop der speicheranfälligen., Darüber hinaus Wiesen die CD38intBcl6hi/intEfnb1+ - Zellen höhere bcl2-und Oberflächen-BCR-Spiegel auf, die wiederum zu Ihrem überleben und Ihrer Entwicklung beitrugen. Wir fanden auch heraus, dass die downregulation von Bcl6 zu einer erhöhten expression von Bcl2 und BCR führte. Angesichts der positiven Korrelation zwischen der Stärke Der T-Zell-Hilfe und der mTORC1-Aktivität legen unsere Daten ein Modell nahe, in dem schwache Hilfe von T-Zellen zusammen mit der Bereitstellung eines erhöhten überlebenssignals für GC-B-Zellen der Schlüssel sind, um ein Gedächtnis-B-Zell-Schicksal anzunehmen., Gedächtnis-B-Zellen und langlebige Plasmazellen sind für eine effektive langfristige Immunität gegen kamagra oral jelly online shop Krankheitserreger verantwortlich.
Die Mehrheit dieser Zellen reagieren auf T cellâÂÂabhängige Antigene werden aus dem keimzentrum (GC) Reaktion erzeugt. In der Tat treten Gedächtnis-B-Zellen als rezirkulierende Zellen aus dem GC hervor und werden bei der sekundären antigen-Herausforderung grundiert, um schnelle antikörperreaktionen kamagra oral jelly online shop hervorzurufen. GCs sind in zwei anatomische Strukturen unterteilt.
Die helle zone (LZ) und die kamagra oral jelly online shop dunkle zone (DZ. Allen et al., 2007. Victora und Nussenzweig, 2012)., B-Zellen vermehren sich und unterliegen einer somatischen hypermutation in der DZ, bevor Sie in die LZ eintreten, wo Sie kamagra oral jelly online shop den Zellzyklus verlassen.
In der LZ fangen GC-B-Zellen, die neu mutierte B-Zell-Rezeptoren (BCR) exprimieren, antigen ein, das auf follikulären dendritischen Zellen präsentiert wird, und verinnerlichen es zur Präsentation in follikuläre Helfer-T-Zellen. AnschlieÃend erfolgt eine antigen-und T-cellâ kamagra oral jelly online shop " - abhängige Selektion, wobei die âÂÅchoiceâ des Recyclings an die DZ zur weiteren affinitätsreifung oder zum Austritt aus dem GC als plasma-oder Speicher-B-Zellen erfolgt., In Bezug auf den selektionsmechanismus wurde postuliert, dass Vorläuferzellen, die dazu bestimmt sind, GC -, plasma-oder Speicher-B-Zellen zu recyceln, bereits in der LZ festgeschrieben werden, zumindest in gewissem MaÃe, danach in die recycling-DZ -, plasma-oder Speicher-B-zellpools eintreten (Inoue et al., 2018). Zum Beispiel wurde gezeigt, dass ein kleiner Anteil von LZ-B-Zellen, die C-Myc exprimieren, einem schlüsselzellzyklusregulator, Vorläuferzellen für das recycling von GCR entspricht.
C-Myc+-Zellen sind für hochaffine BCR angereichert und die kamagra oral jelly online shop ablation von c-Myc beeinflusst den DZ-Wiedereintritt (Calado et al.,, 2012. Dominguez-Sola et al., 2012. Finkin et al., kamagra oral jelly online shop 2019).
Bcl6locd69hi LZ B-Zellen, die IRF4 exprimieren, ein Kritischer Transkriptionsfaktor für die plasmazelldifferenzierung, wurden kürzlich als Vorläufer von Plasmazellen gezeigt (Ise et al., 2018). Im Gegensatz zu diesen Erkenntnissen über die Vorläuferzellen für recycling - und plasmazell-Schicksale wurden Studien zur Entscheidung über das gedächtnisschicksal kamagra oral jelly online shop durch das fehlen eines bekannten master-transkriptionsfaktors für die Differenzierung von Gedächtnis-B-Zellen behindert., Daher wurden Surrogat-Marker wie EIN s1pr2-reporter, EINE ccr6-expression oder ein Zellzyklus-reporter kürzlich zur Identifizierung von speichervorläuferzellen eingesetzt (Laidlaw et al., 2017. König et al., kamagra oral jelly online shop 2017.
Wang et al., 2017). Obwohl informativ, haben diese Studien keine Schlüsselmerkmale für die Entwicklung der GC-abgeleiteten Vorläuferzellen identifiziert, die für das kamagra oral jelly online shop Schicksal langlebiger Speicher-B-Zellen bestimmt sind oder welche Signale diese Schlüsselmerkmale regulieren., Nach der Identifizierung einer speicheranfälligen population (CD38intBcl6hi/int Ephrin-B1 [Efnb1+]) stellten wir fest, dass diese kleine population eine geringere mTORC1-Aktivität aufwies als die speicheranfällige population. Die konstitutiv hohe mTORC1-Aktivität führte zu einer fehlerhaften Entwicklung von CD38intBcl6hi / intEfnb1+ - Zellen, während eine Abnahme der mTORC1-Aktivität zu einer relativen Anreicherung dieser speicheranfälligen Zellpopulation gegenüber der recyclinganfälligen führte.
Darüber hinaus Wiesen die CD38intBcl6hi/intEfnb1+ - Zellen höhere Mengen an Bcl2 und Oberflächen-BCR auf und trugen so zu deren überleben kamagra oral jelly online shop und Entwicklung bei., Wir fanden auch heraus, dass die downregulation von Bcl6 zu einer erhöhten expression von Bcl2 und BCR führte. Angesichts der positiven Korrelation zwischen der Stärke Der T-Zell-Hilfe und der mTORC1-Aktivität (Erwing et al., 2017) schlagen unsere Daten ein Modell vor, in dem schwache Hilfe von T-Zellen zusammen mit der Bereitstellung eines erhöhten überlebenssignals für GC-Zellen der Schlüssel sind, um das Schicksal der Speicher-B-Zelle anzunehmen. Um den initiierenden Prozess für die Differenzierung der Speicher-B-Zellen im kamagra oral jelly online shop GC zu klären, wollten wir GC-B-Zellen identifizieren, die für das speicherschicksal bestimmt sind.
Dazu verwendeten wir bcl6-proteinreportermäuse (Kitano et al., 2011)., Wir immunisierten diese Mäuse mit 4-hydroxy-3-nitrophenylacetyl (NP) âÂÂchicken Ã3-globulin (CGG) in Alaun I. P. Und analysierten NP-spezifische IgG1+ splenic B-Zellen am Tag 10.
Da die CD38-upregulation während des übergangs von GC zu Speicher-B-Zellen stattfindet (Ridderstad und Tarlinton, 1998), untersuchten wir solche CD38+ B-Zellen, die bis zu einem gewissen Grad die GC-Identität beibehielten, dh bcl6+ waren, zusammen mit herkömmlichen CD38âË GC-B-Zellen. Durch Verwendung einer zuvor beschriebenen fraktionierungsmethode (Abb. S1 A.
Ise et al.,, 2018) wurden die LZ-B-Zellen basierend auf Ihrem bcl6-und CD69-Expressionsmuster weiter getrennt (Obere Rechte Tafel in Abb. 1 A). Fraktion (Fr.) 1 (CD38âË'Bcl6loCD69hi) und Fr.2 (CD38Ã¢Ë ' Bcl6hicd69hi) Zellen sind plasma-und recycling-GC-Vorläuferzellen (Ise et al., 2018).
Charakterisierung von Fr.3 (CD38âË'Bcl6hiCD69lo) Zellen wird im folgenden beschrieben. Efnb1 wird von fast allen Fas+GL7+ - Zellen auf hohem Niveau exprimiert, ist aber auf naiven B-Zellen kaum nachweisbar (Laidlaw et al., 2017. Lu et al., 2017.
Wang et al.,, 2017), so dass wir übergangspopulationen zwischen GC-und Speicher-B-Zellen identifizieren können. Daher trennten wir für CD38+ - Zellen unter Verwendung von Efnb1 und Bcl6 die NP+ IgG1+CD38+GL7âË Cd138Ã¢Ë ' - Zellen weiter in Bcl6+Efnb1+ (Fr.5), Bcl6loEfnb1+ (Fr.6), und Bcl6âË'Efnb1âË (Fr.7. Untere Rechte Platte in Abb.
1 A). Seit expressionsniveau von Bcl6 in Fr.5 Zellen war etwas, aber deutlich niedriger als die von Fr.3 Zellen, wie in der linken Tafel in Abb. 1 B, hierin haben wir bcl6hi/int für Fr.5.
CD38 expression Level, auf Fr.5, Fr.6, und Fr.7 Zellen wurden in dieser Reihenfolge erhöht (mittlere Platte in Abb., 1 B. Hierin, angegeben als CD38int, und CD38+ für Fr.5 bzw. 6/7).
Während des zeitlichen Verlaufs der GC-Antwort Fr.5 und Fr.Das teilte Das Unternehmen am Donnerstag mit.7 Zellen erreichten am Tag 12 Ihren Höhepunkt und gingen dann langsam zurück (Abb. S1 B). Diese kinetischen Daten legen nahe, dass Fr.5 und Fr.6 enthalten Zellen, die vorübergehend und Intermediär sind und die, sobald Zellen in die Fr eintreten.7 pool, Sie sind stabil gepflegt.
Die Fr.7 Zellen zeigten einen typischen CD38+Bcl6âË Efnb1Ã¢Ë ' Reifen speicherphänotyp (Abb. 1 B). Zur Beurteilung der Beziehung zwischen Gesamt-LZ - B-Zellen und Fr.,5/6/7 Zellen, führten wir RNA-Sequenzierung (RNA-seq) Analyse (Abb.
S2-A). Um ausreichende Mengen an RNA für diese Analyse zu erhalten, verwendeten wir übertragene B1-8hi-B-Zellen anstelle von nicht-BCR-transgenen Mäusen. Diese NP-spezifischen transgenen GC-B-Zellen waren in ähnlichen Anteilen in jeder Fraktion wie in nicht-BCR-transgenen Mäusen vorhanden (Abb.
S1-C). Die Hauptkomponentenanalyse (principal component analysis, PCA) für jede Fraktion ergab, dass Speicher-B-Zellen (Fr.7) am dichtesten geclustert mit CD38+Bcl6loEfnb1+ (Fr.6) Zellen, die sich jedoch stark von den gesamten Lz-und B-Zellen unterschieden (Abb. 1 C).
Fr.5 Zellen waren zwischen Fr.,6 und Lz-B-Zellen. Fr.6 Zellen exprimierten niedrigere Spiegel von S1pr2 und höhere Spiegel Von gpr183 (EBI2) mRNA im Vergleich zu LZ - B-Zellen (Abb. S1 D), was impliziert, dass Sie eine Zellpopulation beim verlassen des GC sind.
Hierin nennen wir Fr.6 âÂÅpre-Speicher B-Zellen.im Gegensatz zu Fr 6 und Reife Speicher-B-Zellen (Fr.7), Fr.5 Zellen scheinen den Prozess der downregulation von Bcl6 zu starten. Fr.6 Zellen entsprechen höchstwahrscheinlich den bereits identifizierten GC-abgeleiteten präspeicher-B-Zellen (âÂÅEfnb1+S1pr2lo [Pop 4]âÂÂ. Laidlaw et al., 2017), âÂÅLZ CCR6+â (Suan et al., 2017) und âÂÅmKO2hiâ (Wang et al.,, 2017) darin, wie diese Zellen, Fr.6 Zellen sind Bcl6int / loBach2int (Abb.
S3, A und B). Die obigen Daten veranlassten uns, dies unter anderem zu berücksichtigen.2, Fr.3, und Fr.5 Zellen, die CD38intBcl6hi / intEfnb1 + Zellen (Fr.5) könnten potentielle GC-abgeleitete Vorläufer der präspeicher - B-Zellen sein (Fr.6). Um diese Möglichkeit zu testen, haben wir die folgenden drei Ansätze verfolgt.
Zunächst wurde eine PCA der RNA-seq-Daten durchgeführt, was darauf hinweist, dass CD38intBcl6hi / intEfnb1 + - Zellen (Fr.5) und pre-memory - B-Zellen (Fr.6) am engsten zusammengefaÃt (Abb. 1 D)., Zweitens verwendeten wir zur überwachung der zellulären Ruhe transgene mvenus-p27KâË-Mäuse, in denen hauptsächlich G0-phasenzellen markiert sind (Oki et al., 2014), was dies im Gegensatz zu Fr.2 und Fr.3 Zellen, Fr.5 und Fr.6 Zellen hatten mehr mvenus-p27KâË probeâÂÂpositiv, d.h. Ruhende Zellen (Abb.
1 E). SchlieÃlich, um das speicherrückrufpotential der Fr zu bewerten.5 Zellen verwendeten wir eine zuvor beschriebene adoptive transfermethode (Wang et al., 2017). Wie in Abb.
1 F, Fr.2, Fr.3, Fr.5, oder Fr.,6 Zellen wurden aus NP-CGG/Alaun-immunisierten Mäusen isoliert und Adoptiv übertragen (2 à104-Zellen pro Maus) in sublethal bestrahlte empfängermäuse zusammen mit CD4+ T-Zellen, die aus CGG-immunisierten Mäusen isoliert wurden. Die empfängermäuse wurden dann mit NP-CGG herausgefordert und am Tag 6 auf NP-spezifische Plasmazellen analysiert. Obwohl weniger kompetent als pre-memory - B-Zellen (Fr.6), die Fähigkeit der Adoptiv übertragenen CD38intBcl6hi / intEfnb1+ (Fr.5) Zellen, die Plasmazellen hervorrufen, waren Fr signifikant überlegen.2 und Fr.3-Zellen (Abb.
1 G). Um die Möglichkeit auszuschlieÃen, dass Fr.,5 Zellen waren Zellen, die die GC-Reaktion von bereits erzeugten Speicher-B-Zellen neu eingegeben hatten, wir färbten Sie für Ki67 und beobachteten eine geringere expression in Fr.5 als in den pre-GC - B-Zellen, die gerade in den GC eintreten (Abb. S1 E).
Zusammen, CD38intBcl6hi/intEfnb1+ (Fr.5) Zellen sind wahrscheinlich ein Vorläufer von prägedächtnis-B-Zellen, hierin Fr genannt.5 âÂÅpro-memory - B-Zellen, â und eine vorläuferpopulation von zuvor identifizierten pre-memory-B-Zellen darstellen (âÂÅEfnb1+S1pr2lo [Pop 4]âÂÂ. Laidlaw et al., 2017), âÂÅLZ CCR6+â (Suan et al., 2017) und âÂÅmKO2hiâ (Wang et al., 2017. Abb., S3, A und B).
Wir schlieÃen jedoch nicht aus, dass die pro-memory - B-Zellpopulation (Fr.5) ist in seinen Ursprüngen und Eigenschaften heterogen. Zum Beispiel Fr.5 Zellen scheinen sich in gewissem MaÃe mit Lz-ccr6+ - Zellen zu überlappen, indem Sie beginnen, Ccr6 auszudrücken (Abb. S3 C).
Einblick in die Besonderheiten von CD38intBcl6hi/intEfnb1+ (Fr.5) Zellen, die Ihre potentielle Entwicklung und/oder Differenzierung in Gedächtniszellen fördern, verglichen wir Ihr RNA-seq-Profil mit dem der anderen LZ - B-Zellen (Fr.2 und Fr.3. Abb. 2 A und Abb.
S2). CD38âË'Bcl6hiCD69hi (Fr.,2) Zellen sind zum recycling des Schicksals bestimmt (Ise et al., 2018). Gene set enrichment analysis (GSEA) von Hallmark-gen-sets (Liberzon et al., 2015) zeigte eine starke Bereicherung in Fr.2 Zellen von c-Myc-targets, E2F-targets und mTORC1-signalgenen (Abb.
S4 Ein). In übereinstimmung mit der mRNA-Analyse waren die expression von c-Myc-protein, die mTORC1-Aktivität (bewertet durch phospho-S6) und die E2F-Aktivität (bewertet durch phospho-Rb) in Fr signifikant verringert.5 Zellen (Abb. S4-B).
Zur Unterstützung dieser, wenn wir produziert anti-NP IgHV186. 2 IgM " monoklonale Antikörper geklont aus Einzelzelle-sortiert Fr.2 und Fr.,5 NP+IgG1+ B-Zellen und Ihre relative Affinität für NP29 - oder NP1-BSA gemessen, fanden wir eine signifikante überrepräsentation von Antikörpern mit geringerer Affinität in CD38intBcl6hi/intEfnb1+ (Fr.5) Zellen (Abb. 2 B).
Konsequent, die Häufigkeit der kanonischen affinityâ " Verbesserung mutation (Ersatz von Trp33 mit Leu33. W33L+) war niedriger in Fr.5 Zellen (Abb. 2 C).
Daraus schlieÃen wir, dass, im Gegensatz zu CD38âË'Bcl6hiCD69hi (Fr.2) Zellen, die meisten der Fr.5 Zellen besitzen BCR mit geringerer Affinität, ein Hinweis darauf, dass Sie in der LZ weniger T-Zell-Hilfe erhielten (Victora et al., 2010)., Als Nächstes verglichen wir das RNA-seq-Profil von Fr.3 zu Fr.5 Zellen (Abb. 2 A und Abb. S2-A).
Einige Unterschiede wurden zwischen diesen beiden Fraktionen beobachtet. Insbesondere war die expression einiger mTORC1-signalgene in Fr höher.3 als Fr.5 Zellen (Abb. 2 D).
Myc Ausdruck in Fr.3 Zellen war etwas höher im Vergleich zu Fr.5 Zellen (Abb. 2 D). Aufgrund dieser Unterschiede zeigte die GSEA eine Bereicherung der Fr.3 von c-Myc-targets und mTORC1-signalgenen (Abb.
2 E), obwohl der anreicherungsgrad von Fr.3 zu Fr.5 war viel kleiner als Fr.2 zu Fr.5 Zellen (Abb. S4-C)., Durch die Durchflusszytometrie-Analyse von c-Myc und pS6 konnten wir jedoch keine signifikanten Unterschiede sowohl in der C-Myc-Proteinexpression als auch in der mTORC1-Aktivität zwischen Fr.3 und Fr.5 Zellen (Abb. S5 Ein).
Diese Daten legen nahe, dass unsere Durchflusszytometrie-Analyse möglicherweise nicht ausreicht, um kleine Veränderungen zu erkennen, die durch differentielle mRNA-Spiegel zwischen Fr induziert werden.3 und Fr.5 Zellen. Eine alternative Möglichkeit besteht darin, dass zusätzlich zum mRNA-Niveau änderungen in der translations - /posttranslationsregulierung zwischen Fr.3 und Fr.5 Zellen. Der mögliche Grund, warum Fr.5 aber nicht Fr.,3 Zellen können pro-memory-B-Zellen werden, trotz relativ kleiner Unterschiede in den RNA-seq-Profilen zwischen diesen beiden Populationen, wird im folgenden beschrieben.
Um Schlüsseleigenschaften für die Entwicklung von Fr zu identifizieren.5 Zellen und / oder Ihre Aktivität, da Bach2/Blimp1-doppeldefiziente GC-B-Zellen einen Hinweis liefern könnten, da diese mutierten Zellen bei der Erzeugung von GC-abgeleiteten Speicher-B-Zellen defekt sind (Shinnakasu et al., 2016)., Zu diesem Zweck transferierten wir B-Zellen von drei Genotypen (Bach2f / fPrdm1f / fERT2cre B1-8hi, Bach2+ / + Prdm1f / fERT2cre B1-8hi und Bach2+ / +Prdm1+ / +Pr2cre B1-8hi) in empfängermäuse, behandelten Sie mit tamoxifen und immunisierten Sie dann mit NP-CGG / Alaun (Abb. 3 A). Im Gegensatz zu den Kontroll-Wildtyp-und Blimp1-single-deficient-B-Zellen zeigten Bach2/Blimp1-double-deficient-GC-B-Zellen eine Anreicherung in DZ-Zellen (Abb.
3 B). Darüber hinaus enthielt der relativ geringe Anteil an LZ - B-Zellen noch Fr.2 und Fr.3 Zellen, während die zahlen von Fr.5 und Fr.,7 Zellen waren in Bach2/Blimp1-doppeldefizienten B-Zellen robust vermindert (Abb. 3 B).
Da Blimp1 einzigen knockout hatte keinen signifikanten Einfluss auf die Anzahl der pro-Speicher (Fr.5) und Reifen Speicher B-Zellen (Fr.7. Abb. 3 B), kommen wir zu dem Schluss, dass Bach2 eine wichtige Rolle bei der Entwicklung von pro-memory-Zellen und nachfolgenden Reifen memory-B-Zellen spielt.
Um zu bestimmen, wie Bach2 an diesem Prozess teilnimmt, führten wir eine RNA-Profilierung von Bach2/Blimp1-doppeldefizienten LZ-B-Zellen zusammen mit Blimp1-defizienten LZ-B-Zellen als Kontrolle durch (Abb. S2 B)., In Bach2 / Blimp1-doppeldefizienten LZ-B-Zellen zeigte GSEA eine signifikante Anreicherung von c-Myc-zielgenen, E2F-zielgenen und mTORC1-signalgenen in dieser Reihenfolge (Abb. 3 C).
Dies wurde auch durch durchflusszytometrieanalyse nachgewiesen (expressionswerte von c-Myc, pRb und pS6. Abb. 3 D).
Darüber hinaus waren die mutierten GC-B-Zellen erwartungsgemäà hyperproliferativ, wie durch 5-ethynyl-2âÂ2-desoxyuridin (EdU) - pulsmarkierung (Abb. 3 E). Diese Ergebnisse, unter Berücksichtigung der vorherigen demonstration, dass C-Mycâ " überexpression und hyper-mTORC1 GC B-Zellen manifestieren eine Tendenz in Richtung der DZ (Ersching et al.,, 2017.
Finkin et al., 2019), wie Bach2/Blimp1-doppeldefiziente GC-B-Zellen, die Hypothese Aufkommen lieÃen, dass der defekte pro-Speicher in den mutierten GC-Zellen 5could aus Anomalien der mTORC1-und/oder c-Myc-Pfade resultieren. Hier haben wir unsere Analyse auf den mTORC1-Pfad konzentriert. Um diese Hypothese zu testen, fragten wir zuerst, ob die Normalisierung der mTORC1-Aktivität in Bach2/Blimp1-doppeldefizienten GC-Zellen die Entwicklung von pro-Speicher-B-Zellen und nachfolgenden Speicher-B-Zellen retten könnte.
Wir transferierten Bach2f/fPrdm1f / f2cre B1-8hi B-Zellen in rapamycin-resistente (MtorF2108L/F2108L) Wirte (Erwing et al.,, 2017), löschte Bach2 und Prdm1 mit tamoxifen und immunisierte dann die Mäuse mit NP-CGG / Alaun (Abb. 4 A). Nach der Immunisierung wurden die Mäuse mit rapamycin behandelt mTORC1 Aktivität in einer übertragenen B cellâÂÂintrinsische Weise zu verringern.
Wie in Abb. 4 B, die Dosis von rapamycin verwendet fast normalisierten pS6-Spiegel in den Bach2/Blimp1 doppeldefizienten LZ B-Zellen. Die rapamycin-Behandlung korrigierte teilweise die c-Myc-überexpression und hyperproliferation, die in den doppeldefizienten B1-8hi-B-Zellen von Bach2/Blimp1 beobachtet wurden (Abb., 4 B), was darauf hindeutet, dass mTORC1-abhängige und-unabhängige Wege zur Regulierung der C-Myc-Aktivitäten koexistieren.
Im Gegensatz zur kontrollvehikelbehandlung von doppeldefizienten B1-8hi-B-Zellen von Bach2/Blimp1 erzeugten diese mutierten Zellen bei rapamycin-Behandlung eine dreifach höhere Anzahl Von IgG1+ - Speicher-B-Zellen. Die Anzahl Der IgG1+CD73+ Speicher-B-Zellen war ähnlich erhöht (Abb. 4 C, rechts).
AuÃerdem die Fr.5:Fr.Das 2-Verhältnis wurde auch bei rapamycin-Behandlung erhöht (Abb. 4 D)., Die Anzahl der Speicher-B-Zellen bei rapamycin-Behandlung erreichte jedoch bei der Injektion des kontrollfahrzeugs nicht die von Wildtyp-B1-8hi-B-Zellen (Abb. 4 C).
Daher schlieÃen wir, dass die hyper-mTORC1-Aktivität in Bach2/Blimp1-doppeldefizienten GC-B-Zellen einer der Mechanismen ist, die eine fehlerhafte Entwicklung von Speicher-B-Zellen verursachen, obwohl es auch andere, derzeit unbekannte geben muss. In Bezug auf GC-B-Zellen wurden die zahlen bei rapamycin-Behandlung von doppelt mangelhaften B1-8hi-B-Zellen von Bach2/Blimp1 nicht signifikant verändert., Die Neigung von Bach2 / Blimp1-doppeldefizienten GC-B-Zellen zur DZ war bei rapamycin-Behandlung verringert, obwohl noch eine geringe Anreicherung beobachtet wurde (Abb. 4 C).
Um weiter zu untersuchen, ob eine Einschränkung der mTORC1-Aktivität in einer Wildtyp-Umgebung tatsächlich die Differenzierung von GC-B-Zellen zu Speicherzellen erleichtern könnte, führten wir adoptive transferexperimente durch., Zu diesem Zweck führten wir Experimente durch, bei denen zwei Arten von kongenial markierten B-Zellen, rapamycin-empfindliche (Mtor+/+) und rapamycin-resistente (MtorF2108L/F2108L) B1-8ge-B-Zellen, als 1:1-Mischung in rapamycin-resistente Wirte (MtorF2108L/F2108L) übertragen wurden, die mit NP-CGG/Alaun immunisiert und dann mit rapamycin verabreicht wurden. Wie erwartet führte die rapamycin-Behandlung zu einer Abnahme der S6-Phosphorylierung in den übertragenen rapamycin-empfindlichen, aber nicht rapamycin-resistenten B1-8ge-GC-B-Zellen (Abb. 5 A)., Bei rapamycin-Behandlung wurde die Anzahl der rapamycin-empfindlichen NP+ GC-B-Zellen verringert, während die Anzahl der NP+ GC-B-Zellen im Vergleich zu Ihren rapamycin-resistenten Gegenstücken erhöht wurde, die durch konventionelle durchflusszytometrieanalyse beurteilt wurden (Abb.
5 B). Um den übergang von GC-B-Zellen zu Fr direkter zu demonstrieren.7 Zellen, behandelten wir die immunisierten Mäuse mit EdU für 3 d (Tage 10â " 13) vor der Analyse. In dieser Einstellung markiert der Einbau von EdU GC-Zellen, die sich während der Behandlungsdauer teilten, und die daraus resultierenden ruhespeicher-B-Zellen (Abb.
5 C)., Wir haben zuvor bestätigt, dass während dieser Zeit die Mehrheit der proliferierenden Zellen (>95%) GC-B-Zellen und plasmablasten sind (Shinnakasu et al., 2016). Bei rapamycin-Behandlung die Häufigkeit von EdU+IgG1+ Fr.7-Zellen im Vergleich zu GC-Zellen waren unter den rapamycin-empfindlichen B1-8ge-Zellen höher als die rapamycin-resistenten Zellen, was eine rapamycin-vermittelte Erleichterung des übergangs von GC zu Fr zeigte.7-Zellen (Abb. 5 D).
AuÃerdem, nach rapamycin-Behandlung, die zahlen von CD38âË'Bcl6hiCD69hi (Fr.2) und CD38intBcl6hi / intEfnb1+ (Fr.,5) rapamycin-empfindliche B1-8ge-IgG1+ B-Zellen wurden verringert bzw. Aufrechterhalten. Somit ist das Verhältnis von Fr.5 Fr.2 wurde erhöht (Abb.
5 E). Zusammen schlieÃen wir, dass eine relative Bereicherung in Fr.5 über Fr.2 Zellen werden durch rapamycin-Behandlung induziert, wodurch der Allgemeine übergang von GC-B-Zellen zu Speicher-B-Zellen erleichtert wird. Die in Gegenwart von rapamycin erzeugten Speicher-B-Zellen konnten ähnliche rückrufantikörperantworten induzieren wie diejenigen, die in Abwesenheit von rapamycin erzeugt wurden, wie durch adoptive transferexperimente beurteilt (Abb.
5 F). Wir wollten als Nächstes untersuchen, warum Fr.5, aber nicht Fr.,3 Zellen, können werden pro-Speicher B Zellen. Da gab es fast keine Unterschiede in der mTORC1-Aktivität zwischen Fr.5 und Fr.3-Zellen (Abb.
S5 A) scheint ein mTORC1lo-Zustand notwendig, aber nicht ausreichend für die Entwicklung von pro-memory-B-Zellen (Fr.5). Daher müssen zusätzliche Schlüsseleigenschaften für die Entwicklung dieser Zellen erforderlich sein. Da eines der entscheidenden Merkmale reifer Speicher-B-Zellen die Langlebigkeit ist,besteht eine einfache Möglichkeit darin, dass Fr.5 Zellen beginnen, mehr überlebensaktivität zu erlangen.
Cd38intbcl6hi/intEfnb1+ (Fr.,5) Zellen waren weniger apoptotisch im Vergleich zu CD38Ã¢Ë ' Bcl6hicd69lo (Fr.3) Zellen nach aktiver Caspase-3-Färbung (Abb. 6 A). Transkript-Daten (Abb.
6 B) zusammen mit proteinexpressionsdaten (Abb. 6 C) zeigte, dass Die bcl2-expression in Fr hochreguliert war.5 Zellen im Vergleich zu Fr.3 Zellen und noch mehr in pre-memory - B-Zellen (Fr.6). In ähnlicher Weise fanden wir heraus, dass das BCR-expressionsniveau der Zelloberfläche schrittweise von Fr erhöht wurde.3 zu Fr.6 Zellen (Abb.
6 D). Wir beobachteten auch einen leichten Anstieg Der IgG1-und Igñ/Ã2-mRNA-expression in Fr.5 über Fr.,3 Zellen. Somit scheint die Regulierung sowohl des mRNA - als auch des proteinspiegels wirksam zu sein.
Zu prüfen, ob die Bcl2-Familie proteinâÂÂvermittelte überleben Aktivität könnte Auswirkungen auf die Entwicklung von Fr.5 Zellen, verwendeten wir GC-B-Zellen mit haploinsuffizienz von Bim (Bcl2l11. Siehe Materialien und Methoden), ein entgegenwirkender Faktor gegen anti-apoptotische Bcl2-Familienmitglieder (OâÂÂConnor et al., 1998)., Bcl2l11+/+ ERT2cre B1-8ge B-Zellen und Bcl2l11f/ + ERT2cre B1-8ge B-Zellen wurden als 1:1-Mischung in Wildtyp-empfängermäuse übertragen, die dann mit NP-CGG/Alaun immunisiert und am Tag 8 mit tamoxifen behandelt wurden (Abb. 6 E).
Die BIM-mRNA-expression wurde nach tamoxifen-Behandlung in Bcl2l11f/+ GC-B-Zellen auf fast 50% der Kontrollspiegel verringert (Abb. 6 F). In diesem Wettbewerbsumfeld unter den Fr.2/3/5/6 Zellen wurde die Frequenz in Fr am deutlichsten erhöht.5 und Fr.6 Zellen auf Bim haploinsufficiency (Abb.
6 G), obwohl es auch einen bescheidenen Anstieg von Fr gab.3 Zellen., Folglich wurde auch die Frequenz Von bcl2l11f/+ NP+IgG1+CD73+ Speicher-B-Zellen erhöht (Abb. S5-B). Um die Auswirkungen der Oberflächen-BCR-expression auf das überleben zu untersuchen, wurden B1-8ge-flox/ + Er2cre-B-Zellen eingesetzt.
Für diese speziellen Experimente mischten wir diese B-Zellen und kontrollierten B1-8ge/ + B2cre-B-Zellen im Verhältnis 7:3 und transferierten Sie Adoptiv in empfängermäuse, die dann mit NP-CGG/Alaun immunisiert wurden (Abb. 6 H). Wir injizierten tamoxifen am Tag 10 und untersuchten die Oberflächen-BCR-expression am Tag 12, was eine signifikante Abnahme der Fr.,5 Zellen abgeleitet von B1-8ge-flox / + Er2cre B Zellen (Abb.
6 I). Um apoptotische Zellen in diesem experiment nachzuweisen, analysierten wir Mischungen von Fr.5 und Fr.6 Zellen (CD38+Efnb1+), um eine ausreichende Anzahl von Zellen für den assay zu erhalten. Wie in Abb.
6 J, gleichzeitig mit einer verminderten Oberflächen-BCR-expression, gab es eine höhere Häufigkeit von apoptotischen (aCasp3+) Zellen unter pro/pre-memory-Zellen, die von B1-8ge-flox/+ ERT2cre-B-Zellen stammten. In ähnlicher Weise wurde die Häufigkeit apoptotischer Zellen unter den gesamten LZ-GC-Zellen bei der BCR-downregulation erhöht (Abb. S5-C)., Ein kontrollexperiment mit Prdm1f/ + B1-8ge / + Er2cre B-Zellen zeigte, dass eine unspezifische Wirkung auf die Apoptose, die einfach durch Cre-vermittelte doppelstrangbrüche induziert wurde, vernachlässigbar war (Abb.
S5 D). Zusammen schrittweise Erhöhung Der bcl2-und surface-BCR-expression von pro-memory (Fr.5) Zellen zu pre-memory (Fr.6) zu Reifen Gedächtnis B-Zellen sind wahrscheinlich zu Ihrem überleben beitragen. Es ist noch unklar, welche Signale und Prozesse in LZ-GC-Zellen Ihre Differenzierung in Richtung langlebiger Speicher-B-Zellen initiieren., Indem wir uns hier auf die wichtigsten Merkmale für die Entwicklung von GC-abgeleiteten speichervorläufern konzentrieren, zeigen wir, dass ein mTORC1lo-Zustand notwendig ist, um pro-memory-B-Zellen zu entwickeln.
Da mTORC1lo Lz-B-Zellen schwache T-Zell-Hilfe erhalten und infolgedessen eine Apoptose angenommen wurde, wirft dies die Frage auf, wie solche pro-memory-B-Zellen am Absterben gehindert werden und sich in Reife memory-B-Zellen differenzieren können. Unsere Experimente legen nahe, dass die speichervorläufer-B-Zellen höhere Mengen an Bcl2 und Oberflächen-BCR exprimieren und dadurch einen überlebensvorteil erlangen., Wir haben bereits gezeigt, dass Bach2hi LZ GC-B-Zellen prädisponiert sind, sich in Speicher-B-Zellen zu differenzieren (Shinnakasu et al., 2016), was darauf hinweist, dass die speicherzellenverpflichtung bereits in einer Teilmenge von GC-B-Zellen beginnt. Diese speicheranfällige Teilmenge entspricht höchstwahrscheinlich der Fr.5 (CD38intBcl6hi/intEfnb1+ pro-memory) Zellen.
Tatsächlich expression von Bach2 in Fr.5 ist höher als in Fr.2-Zellen (Abb. 2 A und Abb. S3 B).
Fr.6 (pre-memory B) - Zellen scheinen einen weiteren Entwicklungsschritt in Richtung reifer Speicher-B-Zellen zu Durchlaufen, der sich in einer weiteren downregulation von Bcl6 manifestiert (Abb. 1 B)., Wir fanden heraus, dass mTORC1 einen deutlichen Einfluss auf das Verhältnis von speicheranfällig (Fr.5) recycling-anfällig (Fr.2) Bildung von GC - B-Zellen. Rapamycin-Behandlung erhöht den Anteil der Fr.5 Zellen und Umgekehrt eine hyperaktivierung von mTORC1 in der Bach2/Blimp1-doppeldefizienten Einstellung führten zu einem relativen Anstieg der Fr.2-Zellen.
Es können mehrere nicht gegenseitig ausschlieÃende Möglichkeiten in Betracht gezogen werden, um zu erklären, warum eine geringere mTORC1-Aktivität zur Entwicklung gedächtnisanfälliger Zellen beiträgt. Der Zerfall der mTORC1-Aktivität, wenn sich GC - B-Zellen in der DZ vermehren, scheint für Ihre rechtzeitige Rückkehr zur LZ erforderlich zu sein (Erzing et al.,, 2017). Angesichts der Bedeutung der Lz-residency für die gedächtnisdifferenzierung (Bannard et al., 2013) besteht eine Möglichkeit darin, dass die von mTORC1lo auferlegte LZ-residency die Entwicklung von pro-memory-B-Zellen ermöglichen könnte.
Zweitens, abgesehen von dieser räumlichen Anforderung durch modulation von mTORC1 vermittelt, Hemmung von mTORC1, wie bei der Erzeugung von natürlichen killerzellenspeicher gesehen (OâÂÂs Sullivan et al., 2015), kann die autophagie stimulieren und dadurch das überleben von pro-memory-B-Zellen verbessern. SchlieÃlich ist auch bekannt, dass die mTORC1-Aktivität in Speicher-B-Zellen unterdrückt wird (Boothby und Rickert, 2017)., Solche metabolischen Veränderungen, wenn die Zellen in Richtung reifer Speicher-B-Zellen Fortschreiten, scheinen daher bereits in pro-Speicher-Zellen initiiert zu sein, und dies könnte ein notwendiger Erster Schritt zur Erzeugung reifer Speicher-B-Zellen sein. Die teilweise Wiederherstellung von Gedächtnis-B-Zellen durch rapamycin-Behandlung in Bach2/Blimp1-doppeldefizienten GC-Zellen legt nahe, dass zusätzlich zur hyper-mTORC1-Aktivität andere Anomalien in mutierten GC-B-Zellen in Bezug auf die gedächtnisdifferenzierung auftreten.
Einer von Ihnen ist wahrscheinlich der c-Myc-überausdruck, wegen der folgenden., Erstens wurden in rapamycin-behandelten Bach2/Blimp1-doppeldefizienten GC-Zellen immer noch in signifikantem MaÃe eine überexpression von c-Myc und hyperproliferation beobachtet (Abb. 4 B). Zweitens wurde berichtet, dass C-MycâÂÂüberexprimierende GC-Zellen eine signifikante Neigung zur DZ haben (Finkin et al., 2019).
In Anbetracht der Bedeutung der Lz-residency für die gedächtnisdifferenzierung (Bannard et al., 2013) wird angenommen, dass die überexpression von c-Myc die speicherdifferenzierung beeinträchtigt., Daher würden wir vorschlagen, dass sowohl mTORC1-vermittelten Stoffwechsel und c-MycâÂÂvermittelten Zellzyklus progression zu hemmen ist erforderlich, pro-memory - B-Zellen zu entwickeln, und dass Bach2 ist einer der kritischen Regulatoren für beide Wege zu unterdrücken. Funktionell ist bekannt, dass Bach2 als repressiver guardian-Transkriptionsfaktor wirkt (Igarashi et al., 2017). In Bezug auf die Beziehung zwischen Signalisierung und Bach2-expression scheinen sich die mTORC1-Aktivität und die Bach2-expression gegenseitig auszuschlieÃen, da die BCR-induzierte AKT-mTORC1 die Bach2-expression hemmt (Kometani et al.,, 2013), und Bach2 unterdrückt die Transkription von mTORC1-signalmolekülen.
Eine solche negative Rückkopplungsschleife ist charakteristisch für âÂÅbistableâ signaltransduktionsschaltungen, die in zwei stabilen Formaten arbeiten können. Dies könnte zwischen Fr stattfinden.5 und Fr.2-Zellen. Es sollte erwähnt werden, dass Bach2 von der mTORC1-signalmolekülseite einer der Transkriptionsfaktoren ist und wahrscheinlich zusätzliche Faktoren an der transkriptionsregulation von mTORC1-signalgenen beteiligt sind., Zusätzlich zur Verbindung zwischen BCR-signal und Bach2, unter Berücksichtigung der T-Zell-Daten, die zeigen, dass ICOS und integrin ñE in Bach2lo-T-Zellen hochreguliert sind (Grant et al., 2020.
Sidwell et al., 2020), Bach2 könnte an der Verbindung des BCR-Signals mit Der T-Zell-Hilfe beteiligt sein. Zum Beispiel können Bach2lo LZ-GC-Zellen mit hochaffinen BCRs T/B-Wechselwirkungen durch adhäsionsstatus und korezeptorexpression modulieren und die Stärke Der T-Zellfunktion beeinflussen. Dies könnte Bach2 weiter herunterregulieren, da wir zuvor gezeigt haben, dass eine starke T-Zell-Hilfe die Bach2-expression unterdrückt (Shinnakasu et al., 2016)., Nach der Rückkehr in die LZ wird allgemein angenommen, dass Apoptose der Standardweg für LZ - B-Zellen ist.
Hochaffine Zellen werden jedoch geschont und positiv ausgewählt, nachdem Sie auf ausreichende kognitive T-Zell-Hilfe gestoÃen sind (Allen et al., 2007. Victora und Nussenzweig, 2012). Diese verschonten hochaffinen Zellen entsprechen Fr.2 Zellen, während die säumigen apoptotischen LZ-Zellen wahrscheinlich Fr Sind.3 Zellen.
In der Tat, unter LZ GC-Zellen, Fr.3 Zellen wurden die meisten apoptotischen., Hier zeigen wir, dass eine kleine population von pro-memory-B-Zellen in der LZ existiert und trotz scheinbar schwacher T-Zell-Hilfe relativ resistent gegen Apoptose sind. Die Unfähigkeit früherer Studien, solche Apoptose-resistenten LZ-B-Zellen nachzuweisen, ist höchstwahrscheinlich darauf zurückzuführen, dass die Anzahl der pro-memory-Zellen so begrenzt ist (Mayer et al., 2017). Vorherige Daten mit B cellâÂÂspezifischen bcl2-tg Mäusen (Smith et al., 1994) oder Bim Knock-out-Mäusen (Fischer et al., 2007) zeigten, dass solche Mäuse ein vergröÃertes Speicher-B-zellabteil entwickeln., Kürzlich detailliertere Analyse mit den gleichen bcl2-tg-Mäusen (Stewart et al., 2018) lieferte mechanistische Einblicke in das obige Phänomen.
Erstens entstehen bei diesen Mäusen aberrante Populationen scheinbar ruhender Zellen, die Marker von speichervorläuferzellen exprimieren. Zweitens ist eine überexpression von Bcl2 nicht ausreichend, damit DZ-GC - B-Zellen mit beschädigtem BCR die LZ erreichen., Daher ist es in einem physiologischen Umfeld vernünftig zu spekulieren, dass nach der Rückkehr zur LZ in einer Bcl2-unabhängigen Weise, wenn Die bcl2-expression in einigen der LZ-B-Zellen hochreguliert ist, Sie besser in der Lage sind, in der späten G1-phase vor Apoptose gerettet zu werden und sich in Speicher-B-Zellen zu differenzieren. Zur Unterstützung dieser Idee zeigen wir hier, dass unter LZ-GC-Zellen eine kleine Anzahl von pro-memory-B-Zellen (Fr.5), aber nicht Fr.3 Zellen, beginnen, Bcl2 zu regulieren, und diese Entwicklung von pro-memory-B-Zellen wird durch Erhöhte haploinsufficiency erleichtert.
Weil Bach2 Ausdruck in Fr.,5 Zellen ist ähnlich wie Fr.3-Zellen (Abb. S3 B), Bach2 scheint nicht an einer solchen differentiellen überlebensaktivität zwischen Fr beteiligt zu Sein.5 und Fr.3 Zellen. Vielmehr wird wahrscheinlich ein Bach2-Unabhängiger Mechanismus wie Die bcl6-downregulation (nachstehend erörtert) betrieben, wodurch Fr ermöglicht wird.5 Zellen, um genug zu überleben, um sich in gedächtnisvorläuferzellen zu differenzieren.
Im Gegensatz zu Fr.5 Zellen (pro-Speicher), Fr.6 Zellen (vorspeicher) besitzen offenbar mehr überlebensaktivität (Abb. 6 A), möglicherweise Erklärung der generationskinetik zwischen Fr.5 und Fr.6 Zellen. Fr.,6 Zellen wurden in späteren Phasen (Tage 14 und 20) während der Immunantworten mehr akkumuliert (Abb.
S1 B). Die induzierte downregulation der Oberflächen-BCR-expression in pro/pre-memory-B-Zellen führte zu einer erhöhten Apoptose in den pro-memory-B-Zellen. Diese Ergebnisse zusammen mit dem Nachweis, dass pro-memory-B-Zellen höhere Oberflächen-BCR-Spiegel exprimieren, lassen uns vorschlagen, dass das BCR-vermittelte überlebenssignal auch eine Rolle bei der Entwicklung von pro-memory-B-Zellen spielt.
Basierend auf dem vorherigen Bericht, dass die BCR-ablation zum Zelltod führt, der durch konstitutive bcl2-expression verzögert werden kann (Lam et al.,, 1997), betrachteten wir die Möglichkeit, dass eine downregulation der BCR die bcl2-expression in pro/pre-memory-B-Zellen verringern könnte. Wir konnten eine solche Verbindung jedoch nicht erkennen (Daten nicht angezeigt). In naiven B-Zellen ist bekannt, dass der konstitutive PI3-kinaseâÂÂFoxo1-Weg die fehlenden BCR-vermittelten überlebenssignale ersetzt (Srinivasan et al., 2009).
Daher stellt sich die Frage, wie pro-memory-B-Zellen, obwohl Sie mTORC1lo sind (was eine geringere Akt-Aktivität widerspiegelt), ein solches überlebenssignal erzeugen. Da es keinen vergröÃerten GC-Phänotyp bei PTEN - oder Foxo1-knockout-Mäusen gibt (Dominguez-Sola et al.,, 2015. Inoue et al., 2017.
Sander et al., 2015. Suzuki et al., 2003) könnte eine einfache Erklärung sein, dass die Qualität und/oder Quantität von BCR-vermittelten überlebenssignalen zwischen naiven B-Zellen und GC-abgeleiteten Speicher-B-Zellen unterschiedlich ist. Wir liefern Beweise dafür, dass die downregulation von Bcl6 in pro-memory-B-Zellen einer der Mechanismen für die upregulation von Bcl2 und Oberflächen-BCR sein könnte.
Da das Ausmaà Der bcl6-downregulation in pro-memory-B-Zellen jedoch gering ist, könnte eine solche geringfügige änderung nicht für die beobachtete upregulation von Bcl2 und Oberflächen-BCR verantwortlich sein., Daher können unsere Daten die Möglichkeit nicht vollständig ausschlieÃen, dass insbesondere im pro-memory-B-zellenstadium andere Mechanismen wirken könnten, um die upregulation von Bcl2 und BCR zu initiieren. In diesem Fall ist es wahrscheinlich, dass die downregulation von Bcl6 als amplifikationspfad für eine weitere upregulation von Bcl2 und Oberflächen-BCR während der Differenzierung in Richtung reifer Speicher-B-Zellen wirkt., In Bezug auf diesen differenzierungsweg ergänzen unsere Daten unter Verwendung Von bcl6 haploinsufficiency in hohem MaÃe frühere in-vitro-Daten, Wonach die ektopische expression von Bcl6 in B-Zellkulturen die Differenzierung der GC-B-Zellen in Speicher-B-Zellen blockiert (Kuo et al., 2007). Zusammen ist es wahrscheinlich, dass schrittweise Abnahmen Der bcl6-expression (pro-memory >.
Pre-memory >. Reife Speicher-B-Zellen) eine Schlüsselrolle bei der Entwicklung von Speicher-B-Zellen spielen. Dies wirft die Frage auf, wie Bcl6 herunterreguliert wird., Drei Möglichkeiten wurden bereits berichtet.
(1) bei starkem BCR-engagement, Erk-vermittelter Abbau von Bcl6 (Niu et al., 1998). (2) Transkriptions-downregulation von Bcl6, vermittelt durch die CD40-aktivierten IRF4 (Saito et al., 2007). Und (3) downregulation von Bcl6 durch defekte IL-21-Signalisierung (Linterman et al., 2010).
Unter diesen scheint die Letzte Möglichkeit in Bezug auf die Differenzierung von GC zu Speicher-B-Zellen am besten zu unserer Beobachtung zu passen, dass pro-Speicher-B-Zellen BCR mit geringerer Affinität besitzen und dadurch weniger T-Zell-Hilfe erhalten., Darüber hinaus, als Transkriptions circuitâ " Typ Regulierung, der Transkriptionsfaktor Hhex, kritisch für Speicher B-Zell-Differenzierung, wurde vor kurzem berichtet, in downregulation von Bcl6 teilnehmen (Laidlaw et al., 2020). Zusammenfassend liefert diese Studie wichtige Einblicke in die anfangsereignisse für die schicksalsentscheidungen von GC zu Gedächtnis-B-Zellen. Die modulation des Zellstoffwechsels und das überleben spielen eine grundlegende Rolle.
Angesichts der Bedeutung von GC-abgeleiteten Speicher-B-Zellen für den Schutz vor heterologer kamagrainfektion (Leach et al., 2019. Purtha et al.,, 2011) können unsere Erkenntnisse zur Entwicklung effizienter impfstrategien beitragen. Einzellige Suspensionen von splenozyten wurden auf einem FACSCanto II (BD Biosciences) oder einem FACSAria II (BD Biosciences) analysiert und sortiert.
Alexa647-active caspase-3, V500-B220, V450-Bcl6, BV786-CD138, BV510-CD38, V500-CD45.2, BV510-IgG1, PE-IgG1-Antikörper, und BV786-streptavidin gekauft wurden von BD Biosciences. APC-eFluor780-B220, FITC-CD45. 1, PE-CD45.
1, APC-eFluor780-CD45. 1, FITC-CD45.2, APC-eFluor780-CD45. 2, APC-CD69, APC-eFluor780-CD69, eFluor450-CD73, PE-CD86, PerCP-Cy5.,5-GL7-Antikörper, PerCP-Cy5.
5-streptavidin, PE-streptavidin und APC-eFluor780-streptavidin wurden von eBioscience erworben. PE-B220, PE-Cy7-CD138 -, PE-Cy7-CD38, PacificBlue-CD45.1, PE,-CD45.2, biotin -, CD69, PerCP-Cy5.5-CD86, BV421-CXCR4 V450-Ki67-Antikörper, und BV510-streptavidin wurden gekauft von BioLegend. PE-pRb-und PE-pS6-Antikörper wurden aus der Zellsignalisierung erworben.
C-Myc Antikörper wurde von Abcam gekauft. PE-Bcl2-Antikörper wurde von Miltenyi Biotec gekauft. Biotin-Efnb1 Antikörper wurde von R&D Systems gekauft., Alexa488-goat anti-rabbit IgG Antikörper wurde von Thermo Fisher Scientific gekauft.
Für die intrazelluläre Färbung wurden die Zellen fixiert und permeabilisiert, wobei ein Foxp3-färbekit (eBioscience) für Bcl6, Bcl2 und pRb, eine BD Cytofix/Cytoperm-Lösung (BD Biosciences) für pS6 und aktive caspase-3 oder ein True-Nuclear Transcription Factor Staining Buffer Set (BioLegend) für c-Myc verwendet wurden. APC-konjugiertes NP wurde wie zuvor beschrieben hergestellt (Shinnakasu et al., 2016)., Der Einbau von EdU wurde mit einem Click-iT Plus EdU Flow Cytometry Assay Kit (Thermo Fisher Scientific) gemäà den Anweisungen des Herstellers nachgewiesen. Wir danken M.
C. Nussenzweig (Rockefeller University, New York, NY) für B1-8hi Mäusen, T. Okada (RIKEN Center for Integrative Medical Sciences, Kanagawa, Japan) für Bcl6-YFP Mäusen, G.
D. Victora (Rockefeller University) für MtorF2108L Mäuse, und P. D.
Burrows für die kritische Lektüre des Manuskripts. Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse von JSPS KAKENHI unterstützt (JP17K08882 zu T. Inoue.
JP26221306 und JP19H01028 zu T., Kurosaki), der SENSHIN Medical Research Foundation (an T. Inoue), der Mochida Memorial Foundation for Medical and Pharmaceutical Research (an T. Inoue) und einem Forschungsstipendium der Astellas Foundation for Research on Metabolic Disorders (an T.
Inoue und C. Kawai führten die Experimente durch. T.
Inoue und T. Kurosaki entwarfen die Experimente. R.
Kitamura und H. Fukuyama lieferten wesentliche Reagenzien. E.
Kawakami, N. Sax und K. Yamashita führten bioinformatische Analysen durch.
T. Inoue und T. Kurosaki schrieben das Manuskript.,GRIP1 ist ein breit wirkender transkriptioneller coregulator, dessen Rolle in MS / EAE oder in MG in keinem Zustand untersucht wurde.
Um die GRIP1-abhängigen transkriptomveränderungen zu identifizieren, die zu einer neuroinflammation führen, führten wir eine rnaseq-massenanalyse an CD45+Cd11b+ myeloischen Zellen durch, die aus rückenmarksschnüren von WT-und GRIP1-cKO-Mäusen isoliert wurden. Im Einklang mit einem Mangel an offenem Phänotyp in unseren bedingten GRIP1-defizienten Mäusen (Coppo et al., 2016. Rollins et al.,, 2017) zeigte eine CD45+Cd11b+ ZNS-myeloische Zellpopulation, die hauptsächlich aus MG Bestand, bei der Homöostase keine signifikanten transkriptomischen Unterschiede zwischen WT-und GRIP1-cKO-Mäusen (Abb.
5 A, Obere Platte. GRIP1 deletionseffizienz wird auf der rechten Seite als normalisierte lese zählt über âÂÅfloxedâ exon 11 des ncoa2 Gens gezeigt). Im Gegensatz dazu heterogenere aktivierte CD45+Cd11b + - Zellen während der EAE (Abb.
S2-C und Abb. 2 C) präsentierte deutliche transkriptomische Signaturen in WT gegenüber GRIP1-cKO-Mäusen. In der Tat, Gene in WT upreguliert (Abb.
5 A, untere Platte, und Fig., 5 B), wie chemokine und chemokinrezeptoren (Ccl22, Ccr7), antigen-präsentationsmolekül (H2-q10), Komponenten von Komplement (C3, C1ra) und Typ-I-IFN (Trim12c, Oas3), weisen auf Entzündungen und EAE-Pathogenese hin (Belikan et al., 2018. Salter und Stevens, 2017. Scheu et al., 2017).
Interessanterweise wurde ein pool von Genen in WT-Mäusen während der EAE herunterreguliert, blieb jedoch in GRIP1-cKO-Mäusen bestehen (Z. B. Gpr34, P2ry12.
Abb. 5 A, untere Platte, und Fig. 5 B) sind homöostatische Gene, die als MG âÂÅsensomeâ bezeichnet werden (Hickman et al., 2013), die chemotaxis und Gewebereparatur steuert (Lou et al.,, 2016).
Um physiologisch relevante Bahnen zu identifizieren, die differentiell aktiv in myeloischen Zellen aus WT-und GRIP1-cKO-Rückenmark während der EAE sind, führten wir eine quantitative mengenanalyse der Genexpression durch (QuSAGE. Yaari et al., 2013), ein gen-set Bereicherung analysisâÂÂwie Bayes-Methode bietet eine bessere Konten für intergene Korrelationen als die klassische gen-set Bereicherung Analyse. QuSAGE bestimmt die wegweite expression (wegaktivität) durch Kombination von wahrscheinlichkeitsdichtefunktionen für die individuelle Genexpression unter Verwendung numerischer Faltung., Mehrere Wege wurden in den WT-ZNS-myeloidzellen auf höheren Ebenen exprimiert, einschlieÃlich KNOTENÃHNLICHER rezeptorsignalwege (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes) und eines nuklearen rezeptortranskriptionswegs (REACTOME), einschlieÃlich Nr4a2 (Nurr1) und Nr4a3 (Nor-1.
Abb. 5 C). Bemerkenswerterweise wurden auch mehrere schlüsselgene der IFN-Achse (IFN-Signalweg [REACTOME]), einschlieÃlich Irf4, Irf1, Ifng, Ifitm1, Gbp5 und Oas3, auf höheren Ebenen im WT exprimiert (Abb.
5 C), in übereinstimmung mit quantitativen PCR (qPCR)-Daten des gesamten Gehirns und des Rückenmarks (Abb. 3 A und Abb., S5 A) und mit einer nachgewiesenen coaktivatorrolle für GRIP1 im Typ I IFN-Netzwerk in Mä (Flammer et al., 2010. Reily et al., 2006).
Zusammenfassend zeigen diese Daten ein Versagen bei der hochregulierung von Entzündungs-und Typ-I-IFN-Pfaden und der Persistenz der homöostatischen Signatur in GRIP1-cKO-myeloischen Zellen. Es könnte jedoch möglicherweise von der Rolle von GRIP1 in MG, Mä oder beidem herrühren., Um den Beitrag von Residenten versus infiltrierenden myeloischen Zellen zur EAE-Pathogenese zu sezieren, führten wir eine Einzellige RNAseq (scRNAseq)-Analyse aller myeloischen CD45+CD11b+-Zellen aus WT-und GRIP1-cKO-Rückenmark auf dem Höhepunkt von EAE (DPI20) durch. Nach dem herausfiltern minderwertiger barcodes (siehe Materialien und Methoden) analysierten wir 20.376 Zellen (6,427 WT und 11,949 cKO), die 11,093 Gene exprimierten.
Die automatisierte zelltypzuordnung mit singleR ergab vier hauptclusterâ " âÂÅmonozyten, â â ⬠ÅMä, â â ⬠Ådendritische Zellen, â â und âÂÅneutrophilsâ (Abb., 6 A und Tabelle S1) âÂÂund eine groÃe Anzahl von kleineren Clustern, die überwiegend aus lymphoiden zellverunreinigungen zusammengesetzt waren, die während der zellsortierung gesammelt wurden und die gleiche Position in uniform manifold approximation and projection (UMAP) - Koordinaten hatten (Abb. 6 A). Aufgrund einer unausgewogenen GruppengröÃe führten wir eine bootstrapping-Analyse durch, um die Assoziationen zwischen Genotyp und singleR-Zelltypen zu bestimmen.
Wir zählten Zelltypen von 2.000 Zellen, die mit dem Ersatz von jedem Genotyp mit 500 Wiederholungen abgetastet wurden (Abb. 6 B und Abb. S4 Ein)., Diese Analyse zeigte, dass singleR-Monozyten und Neutrophile im cKO häufiger auftraten, während Mä im WT überrepräsentiert waren.
Gab es eine erhebliche überschneidungen zwischen singleR Zelltypen, was entweder das Vorhandensein von Zell-Subpopulationen oder andere Differenzierung/Aktivierung Staaten. Um diese Zustände zu trennen, führten wir Louvain graphâ " basierte community-clustering, das neun Cluster ergab (Abb. 6 C und Tabelle S2).
Cluster 8 entsprach singleR lymphoid cellâ " angereicherte Gruppe (Abb., 6 A. ÃÂÅOthers,â âÂÅT cellsâÂ), während cluster 6 mit kanonischen Neutrophilen Markern hoch angereichert war (Abb. 6, A, D und E).
Cluster 3 ist mit proliferationsmarkern angereichert (Abb. 6 E, Abb. S4 B und Tabelle S4).
Schleudertrajektorienanalysen, die auf cluster 3 verankert sind (siehe Materialien und Methoden), identifizierten zwei haupttrajektorien (3-5-9-7-1 und 3-5-9-2-4-6), die sich am cluster 9 verzweigten (Abb. 6 C und Abb. S4-C).
Die Analyse von Genen, die differentiell entlang von Trajektorien exprimiert wurden, deutete darauf hin, dass die 3-5-9-7-1-Trajektorie wahrscheinlich Monozyten-zu-Mä - übergängen entspricht., Umgekehrt weisen Cluster 2-4-6 einen zunehmenden Gradienten der expression neutrophiler Marker auf (Abb. 6 E. S100a8, S100a9), was darauf hindeutet, dass die Cluster 4 und 2 eine abnehmende Beimischung von Neutrophilen aus cluster 6 enthalten.
Cluster 3 exprimiert monozytäre Marker auf hohem Niveau (Abb. 6 F. Ly6c2, F13a1, Stmn1) und aktivierte Mä/MG-Marker bei niedrigen Werten (Abb.
6, F und G. Cd74, Fth1, Fcgr2b, H2-Aa, Il1b), die sich gegenseitig entlang der Trajektorien ändern. Mä - ähnliche Cluster (1, 7 und 2) enthalten entweder unterschiedliche Anteile von Mä / MG, unterschiedliche aktivierungszustände oder eine Beimischung anderer Zelltypen (Z.,, oligodendrozytenvorläufer.
Tabelle S3). Obwohl die expressionsverteilungen für aktivierte Mä/MG-Marker in diesen Clustern weitgehend vergleichbar sind (Abb. S4 D), die differentielle expression Analysen zwischen WT und cKO stratifiziert nach Louvain-Cluster zeigte, dass Cluster 1, 7, 2, und 4 ausgedrückt Marker der homöostatischen MG auf höheren Ebenen in den Zellen von cKO-Mäusen (Abb.
6 H, Abb. Tabelle S5. Sparc, Siglech, Olfml3 und Tmem119).
Cluster 2 enthielt den gröÃten Prozentsatz von Zellen, die homöostatische MG-Marker exprimierten., Umgekehrt wurden viele Marker aktivierter entzündlicher Mä in diesen Clustern in den WT-Zellen hochreguliert, einschlieÃlich Il1a, Il1r2, Il7r, Ifng, Ctla2s und Nos2 (Abb. 6 I und Tabelle S5)..
Eine noch unbeantwortete Frage ist, was den kleinen Teil Zithromax online kaufen deutschland der aktivierten keimzentrum (GC) B-Zellen antreibt, langlebige ruhespeicher-B-Zellen zu niedrigster preis kamagra werden. Wir fanden hier heraus, dass eine kleine population von GC-abgeleiteten CD38intBcl6hi/intEfnb1+ - Zellen mit niedrigerer mTORC1-Aktivität das niedrigster preis kamagra Schicksal von Speicher-B-Zellen begünstigte. Konstitutiv hohe mTORC1-Aktivität führte zu Defekten bei der Bildung der CD38intBcl6hi / intEfnb1+ - Zellen. Umgekehrt führte eine abnehmende mTORC1-Aktivität zu einer relativen Anreicherung dieser speicheranfälligen population gegenüber der speicheranfälligen., Darüber hinaus Wiesen die CD38intBcl6hi/intEfnb1+ - Zellen höhere bcl2-und Oberflächen-BCR-Spiegel auf, die wiederum zu Ihrem überleben und niedrigster preis kamagra Ihrer Entwicklung beitrugen.
Wir fanden auch heraus, dass die downregulation von Bcl6 zu einer erhöhten expression von Bcl2 und BCR führte. Angesichts der positiven Korrelation zwischen der Stärke Der T-Zell-Hilfe und der mTORC1-Aktivität legen unsere Daten ein Modell nahe, in dem schwache Hilfe von T-Zellen zusammen mit der Bereitstellung niedrigster preis kamagra eines erhöhten überlebenssignals für GC-B-Zellen der Schlüssel sind, um ein Gedächtnis-B-Zell-Schicksal anzunehmen., Gedächtnis-B-Zellen und langlebige Plasmazellen sind für eine effektive langfristige Immunität gegen Krankheitserreger verantwortlich. Die Mehrheit dieser Zellen reagieren auf T cellâÂÂabhängige Antigene werden aus dem keimzentrum (GC) Reaktion erzeugt. In der niedrigster preis kamagra Tat treten Gedächtnis-B-Zellen als rezirkulierende Zellen aus dem GC hervor und werden bei der sekundären antigen-Herausforderung grundiert, um schnelle antikörperreaktionen hervorzurufen.
GCs sind in zwei anatomische Strukturen unterteilt. Die helle zone (LZ) niedrigster preis kamagra und die dunkle zone (DZ. Allen et al., 2007. Victora und Nussenzweig, 2012)., B-Zellen vermehren sich und unterliegen einer somatischen niedrigster preis kamagra hypermutation in der DZ, bevor Sie in die LZ eintreten, wo Sie den Zellzyklus verlassen.
In der LZ fangen GC-B-Zellen, die neu mutierte B-Zell-Rezeptoren (BCR) exprimieren, antigen ein, das auf follikulären dendritischen Zellen präsentiert wird, und verinnerlichen es zur Präsentation in follikuläre Helfer-T-Zellen. AnschlieÃend erfolgt eine antigen-und T-cellâ " - abhängige Selektion, wobei die âÂÅchoiceâ des Recyclings an die DZ zur weiteren affinitätsreifung oder zum Austritt aus dem GC als plasma-oder Speicher-B-Zellen niedrigster preis kamagra erfolgt., In Bezug auf den selektionsmechanismus wurde postuliert, dass Vorläuferzellen, die dazu bestimmt sind, GC -, plasma-oder Speicher-B-Zellen zu recyceln, bereits in der LZ festgeschrieben werden, zumindest in gewissem MaÃe, danach in die recycling-DZ -, plasma-oder Speicher-B-zellpools eintreten (Inoue et al., 2018). Zum Beispiel wurde gezeigt, dass ein kleiner Anteil von LZ-B-Zellen, die C-Myc exprimieren, einem schlüsselzellzyklusregulator, Vorläuferzellen für das recycling von GCR entspricht. C-Myc+-Zellen sind für hochaffine BCR angereichert und die ablation von c-Myc beeinflusst den DZ-Wiedereintritt (Calado et al.,, 2012 niedrigster preis kamagra.
Dominguez-Sola et al., 2012. Finkin et niedrigster preis kamagra al., 2019). Bcl6locd69hi LZ B-Zellen, die IRF4 exprimieren, ein Kritischer Transkriptionsfaktor für die plasmazelldifferenzierung, wurden kürzlich als Vorläufer von Plasmazellen gezeigt (Ise et al., 2018). Im Gegensatz zu diesen Erkenntnissen über die Vorläuferzellen für recycling - und plasmazell-Schicksale wurden Studien zur Entscheidung über das gedächtnisschicksal durch das fehlen eines bekannten master-transkriptionsfaktors für die Differenzierung von Gedächtnis-B-Zellen behindert., niedrigster preis kamagra Daher wurden Surrogat-Marker wie EIN s1pr2-reporter, EINE ccr6-expression oder ein Zellzyklus-reporter kürzlich zur Identifizierung von speichervorläuferzellen eingesetzt (Laidlaw et al., 2017.
König et niedrigster preis kamagra al., 2017. Wang et al., 2017). Obwohl informativ, haben diese Studien keine Schlüsselmerkmale für die Entwicklung der GC-abgeleiteten Vorläuferzellen identifiziert, die für das Schicksal langlebiger Speicher-B-Zellen bestimmt sind oder welche Signale diese Schlüsselmerkmale regulieren., Nach der Identifizierung einer speicheranfälligen population (CD38intBcl6hi/int Ephrin-B1 [Efnb1+]) stellten wir fest, dass diese kleine population eine geringere mTORC1-Aktivität aufwies als die speicheranfällige niedrigster preis kamagra population. Die konstitutiv hohe mTORC1-Aktivität führte zu einer fehlerhaften Entwicklung von CD38intBcl6hi / intEfnb1+ - Zellen, während eine Abnahme der mTORC1-Aktivität zu einer relativen Anreicherung dieser speicheranfälligen Zellpopulation gegenüber der recyclinganfälligen führte.
Darüber hinaus Wiesen die CD38intBcl6hi/intEfnb1+ - Zellen höhere Mengen an Bcl2 und Oberflächen-BCR auf und trugen so zu deren niedrigster preis kamagra überleben und Entwicklung bei., Wir fanden auch heraus, dass die downregulation von Bcl6 zu einer erhöhten expression von Bcl2 und BCR führte. Angesichts der positiven Korrelation zwischen der Stärke Der T-Zell-Hilfe und der mTORC1-Aktivität (Erwing et al., 2017) schlagen unsere Daten ein Modell vor, in dem schwache Hilfe von T-Zellen zusammen mit der Bereitstellung eines erhöhten überlebenssignals für GC-Zellen der Schlüssel sind, um das Schicksal der Speicher-B-Zelle anzunehmen. Um den initiierenden Prozess für die Differenzierung der Speicher-B-Zellen im GC zu klären, wollten wir GC-B-Zellen identifizieren, niedrigster preis kamagra die für das speicherschicksal bestimmt sind. Dazu verwendeten wir bcl6-proteinreportermäuse (Kitano et al., 2011)., Wir immunisierten diese Mäuse mit 4-hydroxy-3-nitrophenylacetyl (NP) âÂÂchicken Ã3-globulin (CGG) in Alaun I.
P. Und analysierten NP-spezifische IgG1+ splenic B-Zellen am Tag 10. Da die CD38-upregulation während des übergangs von GC zu Speicher-B-Zellen stattfindet (Ridderstad und Tarlinton, 1998), untersuchten wir solche CD38+ B-Zellen, die bis zu einem gewissen Grad die GC-Identität beibehielten, dh bcl6+ waren, zusammen mit herkömmlichen CD38âË GC-B-Zellen. Durch Verwendung einer zuvor beschriebenen fraktionierungsmethode (Abb.
S1 A. Ise et al.,, 2018) wurden die LZ-B-Zellen basierend auf Ihrem bcl6-und CD69-Expressionsmuster weiter getrennt (Obere Rechte Tafel in Abb. 1 A). Fraktion (Fr.) 1 (CD38âË'Bcl6loCD69hi) und Fr.2 (CD38Ã¢Ë ' Bcl6hicd69hi) Zellen sind plasma-und recycling-GC-Vorläuferzellen (Ise et al., 2018).
Charakterisierung von Fr.3 (CD38âË'Bcl6hiCD69lo) Zellen wird im folgenden beschrieben. Efnb1 wird von fast allen Fas+GL7+ - Zellen auf hohem Niveau exprimiert, ist aber auf naiven B-Zellen kaum nachweisbar (Laidlaw et al., 2017. Lu et al., 2017. Wang et al.,, 2017), so dass wir übergangspopulationen zwischen GC-und Speicher-B-Zellen identifizieren können.
Daher trennten wir für CD38+ - Zellen unter Verwendung von Efnb1 und Bcl6 die NP+ IgG1+CD38+GL7âË Cd138Ã¢Ë ' - Zellen weiter in Bcl6+Efnb1+ (Fr.5), Bcl6loEfnb1+ (Fr.6), und Bcl6âË'Efnb1âË (Fr.7. Untere Rechte Platte in Abb. 1 A). Seit expressionsniveau von Bcl6 in Fr.5 Zellen war etwas, aber deutlich niedriger als die von Fr.3 Zellen, wie in der linken Tafel in Abb.
1 B, hierin haben wir bcl6hi/int für Fr.5. CD38 expression Level, auf Fr.5, Fr.6, und Fr.7 Zellen wurden in dieser Reihenfolge erhöht (mittlere Platte in Abb., 1 B. Hierin, angegeben als CD38int, und CD38+ für Fr.5 bzw. 6/7).
Während des zeitlichen Verlaufs der GC-Antwort Fr.5 und Fr.Das teilte Das Unternehmen am Donnerstag mit.7 Zellen erreichten am Tag 12 Ihren Höhepunkt und gingen dann langsam zurück (Abb. S1 B). Diese kinetischen Daten legen nahe, dass Fr.5 und Fr.6 enthalten Zellen, die vorübergehend und Intermediär sind und die, sobald Zellen in die Fr eintreten.7 pool, Sie sind stabil gepflegt. Die Fr.7 Zellen zeigten einen typischen CD38+Bcl6âË Efnb1Ã¢Ë ' Reifen speicherphänotyp (Abb.
1 B). Zur Beurteilung der Beziehung zwischen Gesamt-LZ - B-Zellen und Fr.,5/6/7 Zellen, führten wir RNA-Sequenzierung (RNA-seq) Analyse (Abb. S2-A). Um ausreichende Mengen an RNA für diese Analyse zu erhalten, verwendeten wir übertragene B1-8hi-B-Zellen anstelle von nicht-BCR-transgenen Mäusen.
Diese NP-spezifischen transgenen GC-B-Zellen waren in ähnlichen Anteilen in jeder Fraktion wie in nicht-BCR-transgenen Mäusen vorhanden (Abb. S1-C). Die Hauptkomponentenanalyse (principal component analysis, PCA) für jede Fraktion ergab, dass Speicher-B-Zellen (Fr.7) am dichtesten geclustert mit CD38+Bcl6loEfnb1+ (Fr.6) Zellen, die sich jedoch stark von den gesamten Lz-und B-Zellen unterschieden (Abb. 1 C).
Fr.5 Zellen waren zwischen Fr.,6 und Lz-B-Zellen. Fr.6 Zellen exprimierten niedrigere Spiegel von S1pr2 und höhere Spiegel Von gpr183 (EBI2) mRNA im Vergleich zu LZ - B-Zellen (Abb. S1 D), was impliziert, dass Sie eine Zellpopulation beim verlassen des GC sind. Hierin nennen wir Fr.6 âÂÅpre-Speicher B-Zellen.im Gegensatz zu Fr 6 und Reife Speicher-B-Zellen (Fr.7), Fr.5 Zellen scheinen den Prozess der downregulation von Bcl6 zu starten.
Fr.6 Zellen entsprechen höchstwahrscheinlich den bereits identifizierten GC-abgeleiteten präspeicher-B-Zellen (âÂÅEfnb1+S1pr2lo [Pop 4]âÂÂ. Laidlaw et al., 2017), âÂÅLZ CCR6+â (Suan et al., 2017) und âÂÅmKO2hiâ (Wang et al.,, 2017) darin, wie diese Zellen, Fr.6 Zellen sind Bcl6int / loBach2int (Abb. S3, A und B). Die obigen Daten veranlassten uns, dies unter anderem zu berücksichtigen.2, Fr.3, und Fr.5 Zellen, die CD38intBcl6hi / intEfnb1 + Zellen (Fr.5) könnten potentielle GC-abgeleitete Vorläufer der präspeicher - B-Zellen sein (Fr.6).
Um diese Möglichkeit zu testen, haben wir die folgenden drei Ansätze verfolgt. Zunächst wurde eine PCA der RNA-seq-Daten durchgeführt, was darauf hinweist, dass CD38intBcl6hi / intEfnb1 + - Zellen (Fr.5) und pre-memory - B-Zellen (Fr.6) am engsten zusammengefaÃt (Abb. 1 D)., Zweitens verwendeten wir zur überwachung der zellulären Ruhe transgene mvenus-p27KâË-Mäuse, in denen hauptsächlich G0-phasenzellen markiert sind (Oki et al., 2014), was dies im Gegensatz zu Fr.2 und Fr.3 Zellen, Fr.5 und Fr.6 Zellen hatten mehr mvenus-p27KâË probeâÂÂpositiv, d.h. Ruhende Zellen (Abb.
1 E). SchlieÃlich, um das speicherrückrufpotential der Fr zu bewerten.5 Zellen verwendeten wir eine zuvor beschriebene adoptive transfermethode (Wang et al., 2017). Wie in Abb. 1 F, Fr.2, Fr.3, Fr.5, oder Fr.,6 Zellen wurden aus NP-CGG/Alaun-immunisierten Mäusen isoliert und Adoptiv übertragen (2 à104-Zellen pro Maus) in sublethal bestrahlte empfängermäuse zusammen mit CD4+ T-Zellen, die aus CGG-immunisierten Mäusen isoliert wurden.
Die empfängermäuse wurden dann mit NP-CGG herausgefordert und am Tag 6 auf NP-spezifische Plasmazellen analysiert. Obwohl weniger kompetent als pre-memory - B-Zellen (Fr.6), die Fähigkeit der Adoptiv übertragenen CD38intBcl6hi / intEfnb1+ (Fr.5) Zellen, die Plasmazellen hervorrufen, waren Fr signifikant überlegen.2 und Fr.3-Zellen (Abb. 1 G). Um die Möglichkeit auszuschlieÃen, dass Fr.,5 Zellen waren Zellen, die die GC-Reaktion von bereits erzeugten Speicher-B-Zellen neu eingegeben hatten, wir färbten Sie für Ki67 und beobachteten eine geringere expression in Fr.5 als in den pre-GC - B-Zellen, die gerade in den GC eintreten (Abb.
S1 E). Zusammen, CD38intBcl6hi/intEfnb1+ (Fr.5) Zellen sind wahrscheinlich ein Vorläufer von prägedächtnis-B-Zellen, hierin Fr genannt.5 âÂÅpro-memory - B-Zellen, â und eine vorläuferpopulation von zuvor identifizierten pre-memory-B-Zellen darstellen (âÂÅEfnb1+S1pr2lo [Pop 4]âÂÂ. Laidlaw et al., 2017), âÂÅLZ CCR6+â (Suan et al., 2017) und âÂÅmKO2hiâ (Wang et al., 2017. Abb., S3, A und B).
Wir schlieÃen jedoch nicht aus, dass die pro-memory - B-Zellpopulation (Fr.5) ist in seinen Ursprüngen und Eigenschaften heterogen. Zum Beispiel Fr.5 Zellen scheinen sich in gewissem MaÃe mit Lz-ccr6+ - Zellen zu überlappen, indem Sie beginnen, Ccr6 auszudrücken (Abb. S3 C). Einblick in die Besonderheiten von CD38intBcl6hi/intEfnb1+ (Fr.5) Zellen, die Ihre potentielle Entwicklung und/oder Differenzierung in Gedächtniszellen fördern, verglichen wir Ihr RNA-seq-Profil mit dem der anderen LZ - B-Zellen (Fr.2 und Fr.3.
Abb. 2 A und Abb. S2). CD38âË'Bcl6hiCD69hi (Fr.,2) Zellen sind zum recycling des Schicksals bestimmt (Ise et al., 2018).
Gene set enrichment analysis (GSEA) von Hallmark-gen-sets (Liberzon et al., 2015) zeigte eine starke Bereicherung in Fr.2 Zellen von c-Myc-targets, E2F-targets und mTORC1-signalgenen (Abb. S4 Ein). In übereinstimmung mit der mRNA-Analyse waren die expression von c-Myc-protein, die mTORC1-Aktivität (bewertet durch phospho-S6) und die E2F-Aktivität (bewertet durch phospho-Rb) in Fr signifikant verringert.5 Zellen (Abb. S4-B).
Zur Unterstützung dieser, wenn wir produziert anti-NP IgHV186. 2 IgM " monoklonale Antikörper geklont aus Einzelzelle-sortiert Fr.2 und Fr.,5 NP+IgG1+ B-Zellen und Ihre relative Affinität für NP29 - oder NP1-BSA gemessen, fanden wir eine signifikante überrepräsentation von Antikörpern mit geringerer Affinität in CD38intBcl6hi/intEfnb1+ (Fr.5) Zellen (Abb. 2 B). Konsequent, die Häufigkeit der kanonischen affinityâ " Verbesserung mutation (Ersatz von Trp33 mit Leu33.
W33L+) war niedriger in Fr.5 Zellen (Abb. 2 C). Daraus schlieÃen wir, dass, im Gegensatz zu CD38âË'Bcl6hiCD69hi (Fr.2) Zellen, die meisten der Fr.5 Zellen besitzen BCR mit geringerer Affinität, ein Hinweis darauf, dass Sie in der LZ weniger T-Zell-Hilfe erhielten (Victora et al., 2010)., Als Nächstes verglichen wir das RNA-seq-Profil von Fr.3 zu Fr.5 Zellen (Abb. 2 A und Abb.
S2-A). Einige Unterschiede wurden zwischen diesen beiden Fraktionen beobachtet. Insbesondere war die expression einiger mTORC1-signalgene in Fr höher.3 als Fr.5 Zellen (Abb. 2 D).
Myc Ausdruck in Fr.3 Zellen war etwas höher im Vergleich zu Fr.5 Zellen (Abb. 2 D). Aufgrund dieser Unterschiede zeigte die GSEA eine Bereicherung der Fr.3 von c-Myc-targets und mTORC1-signalgenen (Abb. 2 E), obwohl der anreicherungsgrad von Fr.3 zu Fr.5 war viel kleiner als Fr.2 zu Fr.5 Zellen (Abb.
S4-C)., Durch die Durchflusszytometrie-Analyse von c-Myc und pS6 konnten wir jedoch keine signifikanten Unterschiede sowohl in der C-Myc-Proteinexpression als auch in der mTORC1-Aktivität zwischen Fr.3 und Fr.5 Zellen (Abb. S5 Ein). Diese Daten legen nahe, dass unsere Durchflusszytometrie-Analyse möglicherweise nicht ausreicht, um kleine Veränderungen zu erkennen, die durch differentielle mRNA-Spiegel zwischen Fr induziert werden.3 und Fr.5 Zellen. Eine alternative Möglichkeit besteht darin, dass zusätzlich zum mRNA-Niveau änderungen in der translations - /posttranslationsregulierung zwischen Fr.3 und Fr.5 Zellen.
Der mögliche Grund, warum Fr.5 aber nicht Fr.,3 Zellen können pro-memory-B-Zellen werden, trotz relativ kleiner Unterschiede in den RNA-seq-Profilen zwischen diesen beiden Populationen, wird im folgenden beschrieben. Um Schlüsseleigenschaften für die Entwicklung von Fr zu identifizieren.5 Zellen und / oder Ihre Aktivität, da Bach2/Blimp1-doppeldefiziente GC-B-Zellen einen Hinweis liefern könnten, da diese mutierten Zellen bei der Erzeugung von GC-abgeleiteten Speicher-B-Zellen defekt sind (Shinnakasu et al., 2016)., Zu diesem Zweck transferierten wir B-Zellen von drei Genotypen (Bach2f / fPrdm1f / fERT2cre B1-8hi, Bach2+ / + Prdm1f / fERT2cre B1-8hi und Bach2+ / +Prdm1+ / +Pr2cre B1-8hi) in empfängermäuse, behandelten Sie mit tamoxifen und immunisierten Sie dann mit NP-CGG / Alaun (Abb. 3 A). Im Gegensatz zu den Kontroll-Wildtyp-und Blimp1-single-deficient-B-Zellen zeigten Bach2/Blimp1-double-deficient-GC-B-Zellen eine Anreicherung in DZ-Zellen (Abb.
3 B). Darüber hinaus enthielt der relativ geringe Anteil an LZ - B-Zellen noch Fr.2 und Fr.3 Zellen, während die zahlen von Fr.5 und Fr.,7 Zellen waren in Bach2/Blimp1-doppeldefizienten B-Zellen robust vermindert (Abb. 3 B). Da Blimp1 einzigen knockout hatte keinen signifikanten Einfluss auf die Anzahl der pro-Speicher (Fr.5) und Reifen Speicher B-Zellen (Fr.7.
Abb. 3 B), kommen wir zu dem Schluss, dass Bach2 eine wichtige Rolle bei der Entwicklung von pro-memory-Zellen und nachfolgenden Reifen memory-B-Zellen spielt. Um zu bestimmen, wie Bach2 an diesem Prozess teilnimmt, führten wir eine RNA-Profilierung von Bach2/Blimp1-doppeldefizienten LZ-B-Zellen zusammen mit Blimp1-defizienten LZ-B-Zellen als Kontrolle durch (Abb. S2 B)., In Bach2 / Blimp1-doppeldefizienten LZ-B-Zellen zeigte GSEA eine signifikante Anreicherung von c-Myc-zielgenen, E2F-zielgenen und mTORC1-signalgenen in dieser Reihenfolge (Abb.
3 C). Dies wurde auch durch durchflusszytometrieanalyse nachgewiesen (expressionswerte von c-Myc, pRb und pS6. Abb. 3 D).
Darüber hinaus waren die mutierten GC-B-Zellen erwartungsgemäà hyperproliferativ, wie durch 5-ethynyl-2âÂ2-desoxyuridin (EdU) - pulsmarkierung (Abb. 3 E). Diese Ergebnisse, unter Berücksichtigung der vorherigen demonstration, dass C-Mycâ " überexpression und hyper-mTORC1 GC B-Zellen manifestieren eine Tendenz in Richtung der DZ (Ersching et al.,, 2017. Finkin et al., 2019), wie Bach2/Blimp1-doppeldefiziente GC-B-Zellen, die Hypothese Aufkommen lieÃen, dass der defekte pro-Speicher in den mutierten GC-Zellen 5could aus Anomalien der mTORC1-und/oder c-Myc-Pfade resultieren.
Hier haben wir unsere Analyse auf den mTORC1-Pfad konzentriert. Um diese Hypothese zu testen, fragten wir zuerst, ob die Normalisierung der mTORC1-Aktivität in Bach2/Blimp1-doppeldefizienten GC-Zellen die Entwicklung von pro-Speicher-B-Zellen und nachfolgenden Speicher-B-Zellen retten könnte. Wir transferierten Bach2f/fPrdm1f / f2cre B1-8hi B-Zellen in rapamycin-resistente (MtorF2108L/F2108L) Wirte (Erwing et al.,, 2017), löschte Bach2 und Prdm1 mit tamoxifen und immunisierte dann die Mäuse mit NP-CGG / Alaun (Abb. 4 A).
Nach der Immunisierung wurden die Mäuse mit rapamycin behandelt mTORC1 Aktivität in einer übertragenen B cellâÂÂintrinsische Weise zu verringern. Wie in Abb. 4 B, die Dosis von rapamycin verwendet fast normalisierten pS6-Spiegel in den Bach2/Blimp1 doppeldefizienten LZ B-Zellen. Die rapamycin-Behandlung korrigierte teilweise die c-Myc-überexpression und hyperproliferation, die in den doppeldefizienten B1-8hi-B-Zellen von Bach2/Blimp1 beobachtet wurden (Abb., 4 B), was darauf hindeutet, dass mTORC1-abhängige und-unabhängige Wege zur Regulierung der C-Myc-Aktivitäten koexistieren.
Im Gegensatz zur kontrollvehikelbehandlung von doppeldefizienten B1-8hi-B-Zellen von Bach2/Blimp1 erzeugten diese mutierten Zellen bei rapamycin-Behandlung eine dreifach höhere Anzahl Von IgG1+ - Speicher-B-Zellen. Die Anzahl Der IgG1+CD73+ Speicher-B-Zellen war ähnlich erhöht (Abb. 4 C, rechts). AuÃerdem die Fr.5:Fr.Das 2-Verhältnis wurde auch bei rapamycin-Behandlung erhöht (Abb.
4 D)., Die Anzahl der Speicher-B-Zellen bei rapamycin-Behandlung erreichte jedoch bei der Injektion des kontrollfahrzeugs nicht die von Wildtyp-B1-8hi-B-Zellen (Abb. 4 C). Daher schlieÃen wir, dass die hyper-mTORC1-Aktivität in Bach2/Blimp1-doppeldefizienten GC-B-Zellen einer der Mechanismen ist, die eine fehlerhafte Entwicklung von Speicher-B-Zellen verursachen, obwohl es auch andere, derzeit unbekannte geben muss. In Bezug auf GC-B-Zellen wurden die zahlen bei rapamycin-Behandlung von doppelt mangelhaften B1-8hi-B-Zellen von Bach2/Blimp1 nicht signifikant verändert., Die Neigung von Bach2 / Blimp1-doppeldefizienten GC-B-Zellen zur DZ war bei rapamycin-Behandlung verringert, obwohl noch eine geringe Anreicherung beobachtet wurde (Abb.
4 C). Um weiter zu untersuchen, ob eine Einschränkung der mTORC1-Aktivität in einer Wildtyp-Umgebung tatsächlich die Differenzierung von GC-B-Zellen zu Speicherzellen erleichtern könnte, führten wir adoptive transferexperimente durch., Zu diesem Zweck führten wir Experimente durch, bei denen zwei Arten von kongenial markierten B-Zellen, rapamycin-empfindliche (Mtor+/+) und rapamycin-resistente (MtorF2108L/F2108L) B1-8ge-B-Zellen, als 1:1-Mischung in rapamycin-resistente Wirte (MtorF2108L/F2108L) übertragen wurden, die mit NP-CGG/Alaun immunisiert und dann mit rapamycin verabreicht wurden. Wie erwartet führte die rapamycin-Behandlung zu einer Abnahme der S6-Phosphorylierung in den übertragenen rapamycin-empfindlichen, aber nicht rapamycin-resistenten B1-8ge-GC-B-Zellen (Abb. 5 A)., Bei rapamycin-Behandlung wurde die Anzahl der rapamycin-empfindlichen NP+ GC-B-Zellen verringert, während die Anzahl der NP+ GC-B-Zellen im Vergleich zu Ihren rapamycin-resistenten Gegenstücken erhöht wurde, die durch konventionelle durchflusszytometrieanalyse beurteilt wurden (Abb.
5 B). Um den übergang von GC-B-Zellen zu Fr direkter zu demonstrieren.7 Zellen, behandelten wir die immunisierten Mäuse mit EdU für 3 d (Tage 10â " 13) vor der Analyse. In dieser Einstellung markiert der Einbau von EdU GC-Zellen, die sich während der Behandlungsdauer teilten, und die daraus resultierenden ruhespeicher-B-Zellen (Abb. 5 C)., Wir haben zuvor bestätigt, dass während dieser Zeit die Mehrheit der proliferierenden Zellen (>95%) GC-B-Zellen und plasmablasten sind (Shinnakasu et al., 2016).
Bei rapamycin-Behandlung die Häufigkeit von EdU+IgG1+ Fr.7-Zellen im Vergleich zu GC-Zellen waren unter den rapamycin-empfindlichen B1-8ge-Zellen höher als die rapamycin-resistenten Zellen, was eine rapamycin-vermittelte Erleichterung des übergangs von GC zu Fr zeigte.7-Zellen (Abb. 5 D). AuÃerdem, nach rapamycin-Behandlung, die zahlen von CD38âË'Bcl6hiCD69hi (Fr.2) und CD38intBcl6hi / intEfnb1+ (Fr.,5) rapamycin-empfindliche B1-8ge-IgG1+ B-Zellen wurden verringert bzw. Aufrechterhalten.
Somit ist das Verhältnis von Fr.5 Fr.2 wurde erhöht (Abb. 5 E). Zusammen schlieÃen wir, dass eine relative Bereicherung in Fr.5 über Fr.2 Zellen werden durch rapamycin-Behandlung induziert, wodurch der Allgemeine übergang von GC-B-Zellen zu Speicher-B-Zellen erleichtert wird. Die in Gegenwart von rapamycin erzeugten Speicher-B-Zellen konnten ähnliche rückrufantikörperantworten induzieren wie diejenigen, die in Abwesenheit von rapamycin erzeugt wurden, wie durch adoptive transferexperimente beurteilt (Abb.
5 F). Wir wollten als Nächstes untersuchen, warum Fr.5, aber nicht Fr.,3 Zellen, können werden pro-Speicher B Zellen. Da gab es fast keine Unterschiede in der mTORC1-Aktivität zwischen Fr.5 und Fr.3-Zellen (Abb. S5 A) scheint ein mTORC1lo-Zustand notwendig, aber nicht ausreichend für die Entwicklung von pro-memory-B-Zellen (Fr.5).
Daher müssen zusätzliche Schlüsseleigenschaften für die Entwicklung dieser Zellen erforderlich sein. Da eines der entscheidenden Merkmale reifer Speicher-B-Zellen die Langlebigkeit ist,besteht eine einfache Möglichkeit darin, dass Fr.5 Zellen beginnen, mehr überlebensaktivität zu erlangen. Cd38intbcl6hi/intEfnb1+ (Fr.,5) Zellen waren weniger apoptotisch im Vergleich zu CD38Ã¢Ë ' Bcl6hicd69lo (Fr.3) Zellen nach aktiver Caspase-3-Färbung (Abb. 6 A).
Transkript-Daten (Abb. 6 B) zusammen mit proteinexpressionsdaten (Abb. 6 C) zeigte, dass Die bcl2-expression in Fr hochreguliert war.5 Zellen im Vergleich zu Fr.3 Zellen und noch mehr in pre-memory - B-Zellen (Fr.6). In ähnlicher Weise fanden wir heraus, dass das BCR-expressionsniveau der Zelloberfläche schrittweise von Fr erhöht wurde.3 zu Fr.6 Zellen (Abb.
6 D). Wir beobachteten auch einen leichten Anstieg Der IgG1-und Igñ/Ã2-mRNA-expression in Fr.5 über Fr.,3 Zellen. Somit scheint die Regulierung sowohl des mRNA - als auch des proteinspiegels wirksam zu sein. Zu prüfen, ob die Bcl2-Familie proteinâÂÂvermittelte überleben Aktivität könnte Auswirkungen auf die Entwicklung von Fr.5 Zellen, verwendeten wir GC-B-Zellen mit haploinsuffizienz von Bim (Bcl2l11.
Siehe Materialien und Methoden), ein entgegenwirkender Faktor gegen anti-apoptotische Bcl2-Familienmitglieder (OâÂÂConnor et al., 1998)., Bcl2l11+/+ ERT2cre B1-8ge B-Zellen und Bcl2l11f/ + ERT2cre B1-8ge B-Zellen wurden als 1:1-Mischung in Wildtyp-empfängermäuse übertragen, die dann mit NP-CGG/Alaun immunisiert und am Tag 8 mit tamoxifen behandelt wurden (Abb. 6 E). Die BIM-mRNA-expression wurde nach tamoxifen-Behandlung in Bcl2l11f/+ GC-B-Zellen auf fast 50% der Kontrollspiegel verringert (Abb. 6 F).
In diesem Wettbewerbsumfeld unter den Fr.2/3/5/6 Zellen wurde die Frequenz in Fr am deutlichsten erhöht.5 und Fr.6 Zellen auf Bim haploinsufficiency (Abb. 6 G), obwohl es auch einen bescheidenen Anstieg von Fr gab.3 Zellen., Folglich wurde auch die Frequenz Von bcl2l11f/+ NP+IgG1+CD73+ Speicher-B-Zellen erhöht (Abb. S5-B). Um die Auswirkungen der Oberflächen-BCR-expression auf das überleben zu untersuchen, wurden B1-8ge-flox/ + Er2cre-B-Zellen eingesetzt.
Für diese speziellen Experimente mischten wir diese B-Zellen und kontrollierten B1-8ge/ + B2cre-B-Zellen im Verhältnis 7:3 und transferierten Sie Adoptiv in empfängermäuse, die dann mit NP-CGG/Alaun immunisiert wurden (Abb. 6 H). Wir injizierten tamoxifen am Tag 10 und untersuchten die Oberflächen-BCR-expression am Tag 12, was eine signifikante Abnahme der Fr.,5 Zellen abgeleitet von B1-8ge-flox / + Er2cre B Zellen (Abb. 6 I).
Um apoptotische Zellen in diesem experiment nachzuweisen, analysierten wir Mischungen von Fr.5 und Fr.6 Zellen (CD38+Efnb1+), um eine ausreichende Anzahl von Zellen für den assay zu erhalten. Wie in Abb. 6 J, gleichzeitig mit einer verminderten Oberflächen-BCR-expression, gab es eine höhere Häufigkeit von apoptotischen (aCasp3+) Zellen unter pro/pre-memory-Zellen, die von B1-8ge-flox/+ ERT2cre-B-Zellen stammten. In ähnlicher Weise wurde die Häufigkeit apoptotischer Zellen unter den gesamten LZ-GC-Zellen bei der BCR-downregulation erhöht (Abb.
S5-C)., Ein kontrollexperiment mit Prdm1f/ + B1-8ge / + Er2cre B-Zellen zeigte, dass eine unspezifische Wirkung auf die Apoptose, die einfach durch Cre-vermittelte doppelstrangbrüche induziert wurde, vernachlässigbar war (Abb. S5 D). Zusammen schrittweise Erhöhung Der bcl2-und surface-BCR-expression von pro-memory (Fr.5) Zellen zu pre-memory (Fr.6) zu Reifen Gedächtnis B-Zellen sind wahrscheinlich zu Ihrem überleben beitragen. Es ist noch unklar, welche Signale und Prozesse in LZ-GC-Zellen Ihre Differenzierung in Richtung langlebiger Speicher-B-Zellen initiieren., Indem wir uns hier auf die wichtigsten Merkmale für die Entwicklung von GC-abgeleiteten speichervorläufern konzentrieren, zeigen wir, dass ein mTORC1lo-Zustand notwendig ist, um pro-memory-B-Zellen zu entwickeln.
Da mTORC1lo Lz-B-Zellen schwache T-Zell-Hilfe erhalten und infolgedessen eine Apoptose angenommen wurde, wirft dies die Frage auf, wie solche pro-memory-B-Zellen am Absterben gehindert werden und sich in Reife memory-B-Zellen differenzieren können. Unsere Experimente legen nahe, dass die speichervorläufer-B-Zellen höhere Mengen an Bcl2 und Oberflächen-BCR exprimieren und dadurch einen überlebensvorteil erlangen., Wir haben bereits gezeigt, dass Bach2hi LZ GC-B-Zellen prädisponiert sind, sich in Speicher-B-Zellen zu differenzieren (Shinnakasu et al., 2016), was darauf hinweist, dass die speicherzellenverpflichtung bereits in einer Teilmenge von GC-B-Zellen beginnt. Diese speicheranfällige Teilmenge entspricht höchstwahrscheinlich der Fr.5 (CD38intBcl6hi/intEfnb1+ pro-memory) Zellen. Tatsächlich expression von Bach2 in Fr.5 ist höher als in Fr.2-Zellen (Abb.
2 A und Abb. S3 B). Fr.6 (pre-memory B) - Zellen scheinen einen weiteren Entwicklungsschritt in Richtung reifer Speicher-B-Zellen zu Durchlaufen, der sich in einer weiteren downregulation von Bcl6 manifestiert (Abb. 1 B)., Wir fanden heraus, dass mTORC1 einen deutlichen Einfluss auf das Verhältnis von speicheranfällig (Fr.5) recycling-anfällig (Fr.2) Bildung von GC - B-Zellen.
Rapamycin-Behandlung erhöht den Anteil der Fr.5 Zellen und Umgekehrt eine hyperaktivierung von mTORC1 in der Bach2/Blimp1-doppeldefizienten Einstellung führten zu einem relativen Anstieg der Fr.2-Zellen. Es können mehrere nicht gegenseitig ausschlieÃende Möglichkeiten in Betracht gezogen werden, um zu erklären, warum eine geringere mTORC1-Aktivität zur Entwicklung gedächtnisanfälliger Zellen beiträgt. Der Zerfall der mTORC1-Aktivität, wenn sich GC - B-Zellen in der DZ vermehren, scheint für Ihre rechtzeitige Rückkehr zur LZ erforderlich zu sein (Erzing et al.,, 2017). Angesichts der Bedeutung der Lz-residency für die gedächtnisdifferenzierung (Bannard et al., 2013) besteht eine Möglichkeit darin, dass die von mTORC1lo auferlegte LZ-residency die Entwicklung von pro-memory-B-Zellen ermöglichen könnte.
Zweitens, abgesehen von dieser räumlichen Anforderung durch modulation von mTORC1 vermittelt, Hemmung von mTORC1, wie bei der Erzeugung von natürlichen killerzellenspeicher gesehen (OâÂÂs Sullivan et al., 2015), kann die autophagie stimulieren und dadurch das überleben von pro-memory-B-Zellen verbessern. SchlieÃlich ist auch bekannt, dass die mTORC1-Aktivität in Speicher-B-Zellen unterdrückt wird (Boothby und Rickert, 2017)., Solche metabolischen Veränderungen, wenn die Zellen in Richtung reifer Speicher-B-Zellen Fortschreiten, scheinen daher bereits in pro-Speicher-Zellen initiiert zu sein, und dies könnte ein notwendiger Erster Schritt zur Erzeugung reifer Speicher-B-Zellen sein. Die teilweise Wiederherstellung von Gedächtnis-B-Zellen durch rapamycin-Behandlung in Bach2/Blimp1-doppeldefizienten GC-Zellen legt nahe, dass zusätzlich zur hyper-mTORC1-Aktivität andere Anomalien in mutierten GC-B-Zellen in Bezug auf die gedächtnisdifferenzierung auftreten. Einer von Ihnen ist wahrscheinlich der c-Myc-überausdruck, wegen der folgenden., Erstens wurden in rapamycin-behandelten Bach2/Blimp1-doppeldefizienten GC-Zellen immer noch in signifikantem MaÃe eine überexpression von c-Myc und hyperproliferation beobachtet (Abb.
4 B). Zweitens wurde berichtet, dass C-MycâÂÂüberexprimierende GC-Zellen eine signifikante Neigung zur DZ haben (Finkin et al., 2019). In Anbetracht der Bedeutung der Lz-residency für die gedächtnisdifferenzierung (Bannard et al., 2013) wird angenommen, dass die überexpression von c-Myc die speicherdifferenzierung beeinträchtigt., Daher würden wir vorschlagen, dass sowohl mTORC1-vermittelten Stoffwechsel und c-MycâÂÂvermittelten Zellzyklus progression zu hemmen ist erforderlich, pro-memory - B-Zellen zu entwickeln, und dass Bach2 ist einer der kritischen Regulatoren für beide Wege zu unterdrücken. Funktionell ist bekannt, dass Bach2 als repressiver guardian-Transkriptionsfaktor wirkt (Igarashi et al., 2017).
In Bezug auf die Beziehung zwischen Signalisierung und Bach2-expression scheinen sich die mTORC1-Aktivität und die Bach2-expression gegenseitig auszuschlieÃen, da die BCR-induzierte AKT-mTORC1 die Bach2-expression hemmt (Kometani et al.,, 2013), und Bach2 unterdrückt die Transkription von mTORC1-signalmolekülen. Eine solche negative Rückkopplungsschleife ist charakteristisch für âÂÅbistableâ signaltransduktionsschaltungen, die in zwei stabilen Formaten arbeiten können. Dies könnte zwischen Fr stattfinden.5 und Fr.2-Zellen. Es sollte erwähnt werden, dass Bach2 von der mTORC1-signalmolekülseite einer der Transkriptionsfaktoren ist und wahrscheinlich zusätzliche Faktoren an der transkriptionsregulation von mTORC1-signalgenen beteiligt sind., Zusätzlich zur Verbindung zwischen BCR-signal und Bach2, unter Berücksichtigung der T-Zell-Daten, die zeigen, dass ICOS und integrin ñE in Bach2lo-T-Zellen hochreguliert sind (Grant et al., 2020.
Sidwell et al., 2020), Bach2 könnte an der Verbindung des BCR-Signals mit Der T-Zell-Hilfe beteiligt sein. Zum Beispiel können Bach2lo LZ-GC-Zellen mit hochaffinen BCRs T/B-Wechselwirkungen durch adhäsionsstatus und korezeptorexpression modulieren und die Stärke Der T-Zellfunktion beeinflussen. Dies könnte Bach2 weiter herunterregulieren, da wir zuvor gezeigt haben, dass eine starke T-Zell-Hilfe die Bach2-expression unterdrückt (Shinnakasu et al., 2016)., Nach der Rückkehr in die LZ wird allgemein angenommen, dass Apoptose der Standardweg für LZ - B-Zellen ist. Hochaffine Zellen werden jedoch geschont und positiv ausgewählt, nachdem Sie auf ausreichende kognitive T-Zell-Hilfe gestoÃen sind (Allen et al., 2007.
Victora und Nussenzweig, 2012). Diese verschonten hochaffinen Zellen entsprechen Fr.2 Zellen, während die säumigen apoptotischen LZ-Zellen wahrscheinlich Fr Sind.3 Zellen. In der Tat, unter LZ GC-Zellen, Fr.3 Zellen wurden die meisten apoptotischen., Hier zeigen wir, dass eine kleine population von pro-memory-B-Zellen in der LZ existiert und trotz scheinbar schwacher T-Zell-Hilfe relativ resistent gegen Apoptose sind. Die Unfähigkeit früherer Studien, solche Apoptose-resistenten LZ-B-Zellen nachzuweisen, ist höchstwahrscheinlich darauf zurückzuführen, dass die Anzahl der pro-memory-Zellen so begrenzt ist (Mayer et al., 2017).
Vorherige Daten mit B cellâÂÂspezifischen bcl2-tg Mäusen (Smith et al., 1994) oder Bim Knock-out-Mäusen (Fischer et al., 2007) zeigten, dass solche Mäuse ein vergröÃertes Speicher-B-zellabteil entwickeln., Kürzlich detailliertere Analyse mit den gleichen bcl2-tg-Mäusen (Stewart et al., 2018) lieferte mechanistische Einblicke in das obige Phänomen. Erstens entstehen bei diesen Mäusen aberrante Populationen scheinbar ruhender Zellen, die Marker von speichervorläuferzellen exprimieren. Zweitens ist eine überexpression von Bcl2 nicht ausreichend, damit DZ-GC - B-Zellen mit beschädigtem BCR die LZ erreichen., Daher ist es in einem physiologischen Umfeld vernünftig zu spekulieren, dass nach der Rückkehr zur LZ in einer Bcl2-unabhängigen Weise, wenn Die bcl2-expression in einigen der LZ-B-Zellen hochreguliert ist, Sie besser in der Lage sind, in der späten G1-phase vor Apoptose gerettet zu werden und sich in Speicher-B-Zellen zu differenzieren. Zur Unterstützung dieser Idee zeigen wir hier, dass unter LZ-GC-Zellen eine kleine Anzahl von pro-memory-B-Zellen (Fr.5), aber nicht Fr.3 Zellen, beginnen, Bcl2 zu regulieren, und diese Entwicklung von pro-memory-B-Zellen wird durch Erhöhte haploinsufficiency erleichtert.
Weil Bach2 Ausdruck in Fr.,5 Zellen ist ähnlich wie Fr.3-Zellen (Abb. S3 B), Bach2 scheint nicht an einer solchen differentiellen überlebensaktivität zwischen Fr beteiligt zu Sein.5 und Fr.3 Zellen. Vielmehr wird wahrscheinlich ein Bach2-Unabhängiger Mechanismus wie Die bcl6-downregulation (nachstehend erörtert) betrieben, wodurch Fr ermöglicht wird.5 Zellen, um genug zu überleben, um sich in gedächtnisvorläuferzellen zu differenzieren. Im Gegensatz zu Fr.5 Zellen (pro-Speicher), Fr.6 Zellen (vorspeicher) besitzen offenbar mehr überlebensaktivität (Abb.
6 A), möglicherweise Erklärung der generationskinetik zwischen Fr.5 und Fr.6 Zellen. Fr.,6 Zellen wurden in späteren Phasen (Tage 14 und 20) während der Immunantworten mehr akkumuliert (Abb. S1 B). Die induzierte downregulation der Oberflächen-BCR-expression in pro/pre-memory-B-Zellen führte zu einer erhöhten Apoptose in den pro-memory-B-Zellen.
Diese Ergebnisse zusammen mit dem Nachweis, dass pro-memory-B-Zellen höhere Oberflächen-BCR-Spiegel exprimieren, lassen uns vorschlagen, dass das BCR-vermittelte überlebenssignal auch eine Rolle bei der Entwicklung von pro-memory-B-Zellen spielt. Basierend auf dem vorherigen Bericht, dass die BCR-ablation zum Zelltod führt, der durch konstitutive bcl2-expression verzögert werden kann (Lam et al.,, 1997), betrachteten wir die Möglichkeit, dass eine downregulation der BCR die bcl2-expression in pro/pre-memory-B-Zellen verringern könnte. Wir konnten eine solche Verbindung jedoch nicht erkennen (Daten nicht angezeigt). In naiven B-Zellen ist bekannt, dass der konstitutive PI3-kinaseâÂÂFoxo1-Weg die fehlenden BCR-vermittelten überlebenssignale ersetzt (Srinivasan et al., 2009).
Daher stellt sich die Frage, wie pro-memory-B-Zellen, obwohl Sie mTORC1lo sind (was eine geringere Akt-Aktivität widerspiegelt), ein solches überlebenssignal erzeugen. Da es keinen vergröÃerten GC-Phänotyp bei PTEN - oder Foxo1-knockout-Mäusen gibt (Dominguez-Sola et al.,, 2015. Inoue et al., 2017. Sander et al., 2015.
Suzuki et al., 2003) könnte eine einfache Erklärung sein, dass die Qualität und/oder Quantität von BCR-vermittelten überlebenssignalen zwischen naiven B-Zellen und GC-abgeleiteten Speicher-B-Zellen unterschiedlich ist. Wir liefern Beweise dafür, dass die downregulation von Bcl6 in pro-memory-B-Zellen einer der Mechanismen für die upregulation von Bcl2 und Oberflächen-BCR sein könnte. Da das Ausmaà Der bcl6-downregulation in pro-memory-B-Zellen jedoch gering ist, könnte eine solche geringfügige änderung nicht für die beobachtete upregulation von Bcl2 und Oberflächen-BCR verantwortlich sein., Daher können unsere Daten die Möglichkeit nicht vollständig ausschlieÃen, dass insbesondere im pro-memory-B-zellenstadium andere Mechanismen wirken könnten, um die upregulation von Bcl2 und BCR zu initiieren. In diesem Fall ist es wahrscheinlich, dass die downregulation von Bcl6 als amplifikationspfad für eine weitere upregulation von Bcl2 und Oberflächen-BCR während der Differenzierung in Richtung reifer Speicher-B-Zellen wirkt., In Bezug auf diesen differenzierungsweg ergänzen unsere Daten unter Verwendung Von bcl6 haploinsufficiency in hohem MaÃe frühere in-vitro-Daten, Wonach die ektopische expression von Bcl6 in B-Zellkulturen die Differenzierung der GC-B-Zellen in Speicher-B-Zellen blockiert (Kuo et al., 2007).
Zusammen ist es wahrscheinlich, dass schrittweise Abnahmen Der bcl6-expression (pro-memory >. Pre-memory >. Reife Speicher-B-Zellen) eine Schlüsselrolle bei der Entwicklung von Speicher-B-Zellen spielen. Dies wirft die Frage auf, wie Bcl6 herunterreguliert wird., Drei Möglichkeiten wurden bereits berichtet.
(1) bei starkem BCR-engagement, Erk-vermittelter Abbau von Bcl6 (Niu et al., 1998). (2) Transkriptions-downregulation von Bcl6, vermittelt durch die CD40-aktivierten IRF4 (Saito et al., 2007). Und (3) downregulation von Bcl6 durch defekte IL-21-Signalisierung (Linterman et al., 2010). Unter diesen scheint die Letzte Möglichkeit in Bezug auf die Differenzierung von GC zu Speicher-B-Zellen am besten zu unserer Beobachtung zu passen, dass pro-Speicher-B-Zellen BCR mit geringerer Affinität besitzen und dadurch weniger T-Zell-Hilfe erhalten., Darüber hinaus, als Transkriptions circuitâ " Typ Regulierung, der Transkriptionsfaktor Hhex, kritisch für Speicher B-Zell-Differenzierung, wurde vor kurzem berichtet, in downregulation von Bcl6 teilnehmen (Laidlaw et al., 2020).
Zusammenfassend liefert diese Studie wichtige Einblicke in die anfangsereignisse für die schicksalsentscheidungen von GC zu Gedächtnis-B-Zellen. Die modulation des Zellstoffwechsels und das überleben spielen eine grundlegende Rolle. Angesichts der Bedeutung von GC-abgeleiteten Speicher-B-Zellen für den Schutz vor heterologer kamagrainfektion (Leach et al., 2019. Purtha et al.,, 2011) können unsere Erkenntnisse zur Entwicklung effizienter impfstrategien beitragen.
Einzellige Suspensionen von splenozyten wurden auf einem FACSCanto II (BD Biosciences) oder einem FACSAria II (BD Biosciences) analysiert und sortiert. Alexa647-active caspase-3, V500-B220, V450-Bcl6, BV786-CD138, BV510-CD38, V500-CD45.2, BV510-IgG1, PE-IgG1-Antikörper, und BV786-streptavidin gekauft wurden von BD Biosciences. APC-eFluor780-B220, FITC-CD45. 1, PE-CD45.
1, APC-eFluor780-CD45. 1, FITC-CD45.2, APC-eFluor780-CD45. 2, APC-CD69, APC-eFluor780-CD69, eFluor450-CD73, PE-CD86, PerCP-Cy5.,5-GL7-Antikörper, PerCP-Cy5. 5-streptavidin, PE-streptavidin und APC-eFluor780-streptavidin wurden von eBioscience erworben.
PE-B220, PE-Cy7-CD138 -, PE-Cy7-CD38, PacificBlue-CD45.1, PE,-CD45.2, biotin -, CD69, PerCP-Cy5.5-CD86, BV421-CXCR4 V450-Ki67-Antikörper, und BV510-streptavidin wurden gekauft von BioLegend. PE-pRb-und PE-pS6-Antikörper wurden aus der Zellsignalisierung erworben. C-Myc Antikörper wurde von Abcam gekauft. PE-Bcl2-Antikörper wurde von Miltenyi Biotec gekauft.
Biotin-Efnb1 Antikörper wurde von R&D Systems gekauft., Alexa488-goat anti-rabbit IgG Antikörper wurde von Thermo Fisher Scientific gekauft. Für die intrazelluläre Färbung wurden die Zellen fixiert und permeabilisiert, wobei ein Foxp3-färbekit (eBioscience) für Bcl6, Bcl2 und pRb, eine BD Cytofix/Cytoperm-Lösung (BD Biosciences) für pS6 und aktive caspase-3 oder ein True-Nuclear Transcription Factor Staining Buffer Set (BioLegend) für c-Myc verwendet wurden. APC-konjugiertes NP wurde wie zuvor beschrieben hergestellt (Shinnakasu et al., 2016)., Der Einbau von EdU wurde mit einem Click-iT Plus EdU Flow Cytometry Assay Kit (Thermo Fisher Scientific) gemäà den Anweisungen des Herstellers nachgewiesen. Wir danken M.
C. Nussenzweig (Rockefeller University, New York, NY) für B1-8hi Mäusen, T. Okada (RIKEN Center for Integrative Medical Sciences, Kanagawa, Japan) für Bcl6-YFP Mäusen, G. D.
Victora (Rockefeller University) für MtorF2108L Mäuse, und P. D. Burrows für die kritische Lektüre des Manuskripts. Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse von JSPS KAKENHI unterstützt (JP17K08882 zu T.
Inoue. JP26221306 und JP19H01028 zu T., Kurosaki), der SENSHIN Medical Research Foundation (an T. Inoue), der Mochida Memorial Foundation for Medical and Pharmaceutical Research (an T. Inoue) und einem Forschungsstipendium der Astellas Foundation for Research on Metabolic Disorders (an T.
Kawai führten die Experimente durch. T. Inoue und T. Kurosaki entwarfen die Experimente.
Kitamura und H. Fukuyama lieferten wesentliche Reagenzien. E. Kawakami, N.
Sax und K. Yamashita führten bioinformatische Analysen durch. T. Inoue und T.
Kurosaki schrieben das Manuskript.,GRIP1 ist ein breit wirkender transkriptioneller coregulator, dessen Rolle in MS / EAE oder in MG in keinem Zustand untersucht wurde. Um die GRIP1-abhängigen transkriptomveränderungen zu identifizieren, die zu einer neuroinflammation führen, führten wir eine rnaseq-massenanalyse an CD45+Cd11b+ myeloischen Zellen durch, die aus rückenmarksschnüren von WT-und GRIP1-cKO-Mäusen isoliert wurden. Im Einklang mit einem Mangel an offenem Phänotyp in unseren bedingten GRIP1-defizienten Mäusen (Coppo et al., 2016. Rollins et al.,, 2017) zeigte eine CD45+Cd11b+ ZNS-myeloische Zellpopulation, die hauptsächlich aus MG Bestand, bei der Homöostase keine signifikanten transkriptomischen Unterschiede zwischen WT-und GRIP1-cKO-Mäusen (Abb.
5 A, Obere Platte. GRIP1 deletionseffizienz wird auf der rechten Seite als normalisierte lese zählt über âÂÅfloxedâ exon 11 des ncoa2 Gens gezeigt). Im Gegensatz dazu heterogenere aktivierte CD45+Cd11b + - Zellen während der EAE (Abb. S2-C und Abb.
2 C) präsentierte deutliche transkriptomische Signaturen in WT gegenüber GRIP1-cKO-Mäusen. In der Tat, Gene in WT upreguliert (Abb. 5 A, untere Platte, und Fig., 5 B), wie chemokine und chemokinrezeptoren (Ccl22, Ccr7), antigen-präsentationsmolekül (H2-q10), Komponenten von Komplement (C3, C1ra) und Typ-I-IFN (Trim12c, Oas3), weisen auf Entzündungen und EAE-Pathogenese hin (Belikan et al., 2018. Salter und Stevens, 2017.
Scheu et al., 2017). Interessanterweise wurde ein pool von Genen in WT-Mäusen während der EAE herunterreguliert, blieb jedoch in GRIP1-cKO-Mäusen bestehen (Z. B. Gpr34, P2ry12.
Abb. 5 A, untere Platte, und Fig. 5 B) sind homöostatische Gene, die als MG âÂÅsensomeâ bezeichnet werden (Hickman et al., 2013), die chemotaxis und Gewebereparatur steuert (Lou et al.,, 2016). Um physiologisch relevante Bahnen zu identifizieren, die differentiell aktiv in myeloischen Zellen aus WT-und GRIP1-cKO-Rückenmark während der EAE sind, führten wir eine quantitative mengenanalyse der Genexpression durch (QuSAGE.
Yaari et al., 2013), ein gen-set Bereicherung analysisâÂÂwie Bayes-Methode bietet eine bessere Konten für intergene Korrelationen als die klassische gen-set Bereicherung Analyse. QuSAGE bestimmt die wegweite expression (wegaktivität) durch Kombination von wahrscheinlichkeitsdichtefunktionen für die individuelle Genexpression unter Verwendung numerischer Faltung., Mehrere Wege wurden in den WT-ZNS-myeloidzellen auf höheren Ebenen exprimiert, einschlieÃlich KNOTENÃHNLICHER rezeptorsignalwege (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes) und eines nuklearen rezeptortranskriptionswegs (REACTOME), einschlieÃlich Nr4a2 (Nurr1) und Nr4a3 (Nor-1. Abb. 5 C).
Bemerkenswerterweise wurden auch mehrere schlüsselgene der IFN-Achse (IFN-Signalweg [REACTOME]), einschlieÃlich Irf4, Irf1, Ifng, Ifitm1, Gbp5 und Oas3, auf höheren Ebenen im WT exprimiert (Abb. 5 C), in übereinstimmung mit quantitativen PCR (qPCR)-Daten des gesamten Gehirns und des Rückenmarks (Abb. 3 A und Abb., S5 A) und mit einer nachgewiesenen coaktivatorrolle für GRIP1 im Typ I IFN-Netzwerk in Mä (Flammer et al., 2010. Reily et al., 2006).
Zusammenfassend zeigen diese Daten ein Versagen bei der hochregulierung von Entzündungs-und Typ-I-IFN-Pfaden und der Persistenz der homöostatischen Signatur in GRIP1-cKO-myeloischen Zellen. Es könnte jedoch möglicherweise von der Rolle von GRIP1 in MG, Mä oder beidem herrühren., Um den Beitrag von Residenten versus infiltrierenden myeloischen Zellen zur EAE-Pathogenese zu sezieren, führten wir eine Einzellige RNAseq (scRNAseq)-Analyse aller myeloischen CD45+CD11b+-Zellen aus WT-und GRIP1-cKO-Rückenmark auf dem Höhepunkt von EAE (DPI20) durch. Nach dem herausfiltern minderwertiger barcodes (siehe Materialien und Methoden) analysierten wir 20.376 Zellen (6,427 WT und 11,949 cKO), die 11,093 Gene exprimierten. Die automatisierte zelltypzuordnung mit singleR ergab vier hauptclusterâ " âÂÅmonozyten, â â ⬠ÅMä, â â ⬠Ådendritische Zellen, â â und âÂÅneutrophilsâ (Abb., 6 A und Tabelle S1) âÂÂund eine groÃe Anzahl von kleineren Clustern, die überwiegend aus lymphoiden zellverunreinigungen zusammengesetzt waren, die während der zellsortierung gesammelt wurden und die gleiche Position in uniform manifold approximation and projection (UMAP) - Koordinaten hatten (Abb.
6 A). Aufgrund einer unausgewogenen GruppengröÃe führten wir eine bootstrapping-Analyse durch, um die Assoziationen zwischen Genotyp und singleR-Zelltypen zu bestimmen. Wir zählten Zelltypen von 2.000 Zellen, die mit dem Ersatz von jedem Genotyp mit 500 Wiederholungen abgetastet wurden (Abb. 6 B und Abb.
S4 Ein)., Diese Analyse zeigte, dass singleR-Monozyten und Neutrophile im cKO häufiger auftraten, während Mä im WT überrepräsentiert waren. Gab es eine erhebliche überschneidungen zwischen singleR Zelltypen, was entweder das Vorhandensein von Zell-Subpopulationen oder andere Differenzierung/Aktivierung Staaten. Um diese Zustände zu trennen, führten wir Louvain graphâ " basierte community-clustering, das neun Cluster ergab (Abb. 6 C und Tabelle S2).
Cluster 8 entsprach singleR lymphoid cellâ " angereicherte Gruppe (Abb., 6 A. ÃÂÅOthers,â âÂÅT cellsâÂ), während cluster 6 mit kanonischen Neutrophilen Markern hoch angereichert war (Abb. 6, A, D und E). Cluster 3 ist mit proliferationsmarkern angereichert (Abb.
6 E, Abb. S4 B und Tabelle S4). Schleudertrajektorienanalysen, die auf cluster 3 verankert sind (siehe Materialien und Methoden), identifizierten zwei haupttrajektorien (3-5-9-7-1 und 3-5-9-2-4-6), die sich am cluster 9 verzweigten (Abb. 6 C und Abb.
S4-C). Die Analyse von Genen, die differentiell entlang von Trajektorien exprimiert wurden, deutete darauf hin, dass die 3-5-9-7-1-Trajektorie wahrscheinlich Monozyten-zu-Mä - übergängen entspricht., Umgekehrt weisen Cluster 2-4-6 einen zunehmenden Gradienten der expression neutrophiler Marker auf (Abb. 6 E. S100a8, S100a9), was darauf hindeutet, dass die Cluster 4 und 2 eine abnehmende Beimischung von Neutrophilen aus cluster 6 enthalten.
Cluster 3 exprimiert monozytäre Marker auf hohem Niveau (Abb. 6 F. Ly6c2, F13a1, Stmn1) und aktivierte Mä/MG-Marker bei niedrigen Werten (Abb. 6, F und G.
Cd74, Fth1, Fcgr2b, H2-Aa, Il1b), die sich gegenseitig entlang der Trajektorien ändern. Mä - ähnliche Cluster (1, 7 und 2) enthalten entweder unterschiedliche Anteile von Mä / MG, unterschiedliche aktivierungszustände oder eine Beimischung anderer Zelltypen (Z.,, oligodendrozytenvorläufer. Tabelle S3). Obwohl die expressionsverteilungen für aktivierte Mä/MG-Marker in diesen Clustern weitgehend vergleichbar sind (Abb.
S4 D), die differentielle expression Analysen zwischen WT und cKO stratifiziert nach Louvain-Cluster zeigte, dass Cluster 1, 7, 2, und 4 ausgedrückt Marker der homöostatischen MG auf höheren Ebenen in den Zellen von cKO-Mäusen (Abb. 6 H, Abb. Tabelle S5. Sparc, Siglech, Olfml3 und Tmem119).
Cluster 2 enthielt den gröÃten Prozentsatz von Zellen, die homöostatische MG-Marker exprimierten., Umgekehrt wurden viele Marker aktivierter entzündlicher Mä in diesen Clustern in den WT-Zellen hochreguliert, einschlieÃlich Il1a, Il1r2, Il7r, Ifng, Ctla2s und Nos2 (Abb. 6 I und Tabelle S5)..